邢 軍 白佳寧 蔡長華 (遼寧省人民醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 006)

重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)心肌梗死大鼠腫瘤壞死因子－α表達(dá)的影響

邢 軍 白佳寧1蔡長華 (遼寧省人民醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 110016)

目的 探討重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)對(duì)心肌梗死(MI)大鼠心肌腫瘤壞死因子(TNF)－α表達(dá)的影響。方法 45只SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、MI組和rhEPO治療組。用ELISA方法檢測各組大鼠血清中TNF－α水平，RT－PCR方法檢測梗死區(qū)及其周圍心肌TNF－α mRNA表達(dá)變化。結(jié)果 MI組血清中TNF－α水平、梗死區(qū)及其周圍心肌TNF－α mRNA表達(dá)顯著高于Sham組(P＜0.05);與MI組相比，rhEPO治療組血清中TNF－α水平、梗死區(qū)及其周圍心肌TNF－α mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論 rhEPO可能通過下調(diào)TNF－α改善MI大鼠的心功能。

重組人促紅細(xì)胞生成素;心肌梗死;腫瘤壞死因子－α

心肌梗死 (MI)時(shí)，心肌細(xì)胞出現(xiàn)不可逆的液化性壞死，喪失正常的泵血功能，最終可導(dǎo)致心力衰竭 (HF)的發(fā)生。目前對(duì)于MI的治療方法，只能恢復(fù)梗死區(qū)早期再灌注改善心肌供血，但不能修復(fù)或逆轉(zhuǎn)已壞死的心肌。促紅細(xì)胞生成素 (EPO)是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的糖蛋白，刺激骨髓的造血干細(xì)胞向紅細(xì)胞分化〔1〕。EPO的生物學(xué)效應(yīng)是通過激活特異性EPO受體并啟動(dòng)相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)的〔2〕。重組人EPO(rhEPO)含有與天然分離的EPO完全相同的氨基酸序列，且具有相同的生物學(xué)活性，研究發(fā)現(xiàn)，它能夠?qū)C(jī)體供氧狀況發(fā)揮重要的調(diào)控作用〔3〕，在臨床應(yīng)用EPO治療貧血合并充血性HF患者，可觀查到患者的心功能得到了顯著改善〔4〕，但是其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。腫瘤壞死因子(TNF)－α是體內(nèi)的一個(gè)重要炎性因子，能夠激發(fā)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，繼而造成細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘生其他的炎性介質(zhì)從不同的環(huán)節(jié)參與炎性反應(yīng)，引起器官組織損傷，是炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要啟動(dòng)因子〔5〕，研究發(fā)現(xiàn)，在人類HF中，抗TNF－α治療可以減輕或逆轉(zhuǎn)左室重塑和心室擴(kuò)張〔6〕，但是，rhEPO能否通過調(diào)節(jié)TNF－α的表達(dá)參與MI的炎性機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本研究觀察MI大鼠的血清和梗死及周圍區(qū)域組織的TNF－α的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 rhEPO注射液(沈陽三生制藥有限公司);大鼠TNF－α ELISA試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)，DH－150動(dòng)物人工呼吸機(jī)(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠)，Med lab－U/4CS生物信號(hào)采集儀(南京美易科技有限公司)，高速離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)，OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics公司)。

1.2 動(dòng)物模型的建立及分組 SD大鼠45只(由中國醫(yī)大動(dòng)物室提供)，隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(Sham組)、rhEPO治療組、MI組。方法參考馬驥等〔7〕大鼠經(jīng)水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)板上，行頸部切開氣管并插管，用動(dòng)物人工呼吸機(jī)進(jìn)行人工呼吸，于第4肋間開胸，剪開心包，暴露心臟、血管。在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，此時(shí)可見到左冠狀動(dòng)脈前降支供血區(qū)域變白，結(jié)扎成功標(biāo)志為左心室前壁顏色變白和運(yùn)動(dòng)減弱。仔細(xì)檢查心臟無出血時(shí)關(guān)胸。待動(dòng)物出現(xiàn)吞咽動(dòng)作后拔除氣管插管。手術(shù)后腹腔內(nèi)注射青霉素40萬U以預(yù)防感染，并在30℃條件下蘇醒。其中rhEPO治療組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈同時(shí)，術(shù)后每天腹腔注射rhEPO(1 000 U/kg);MI組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，并從術(shù)后每天腹腔注射等量的生理鹽水，Sham組只開胸，不給予藥物，術(shù)后給予等量生理鹽水腹腔注射。

1.3 ELISA方法檢測大鼠血清TNF－α含量 給藥30 d后，處死大鼠，股動(dòng)脈采血，采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測血清TNF－α含量，嚴(yán)格按照說明書完成。

1.4 RT－PCR方法檢測 麻醉處死各組大鼠，冰上取出大鼠心臟，迅速凍存于－70℃冰箱備用。按RNAout說明書進(jìn)行總mRNA提取，然后以逆轉(zhuǎn)錄(RT法)先合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增;TNF－α 上游引物:5′－CGAGTGACAAGCCCGTAGCC－3′;下游引 物:5′－GGATGAACACGCCAGTCGCC－3′，擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 全 長255 bp。β－actin 的上游引物:5′－GAGACCTTCAACACCCAGCC3′;下游引物為:5′－GCGGGGCATCGGAACCGCTCA－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物全長374 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進(jìn)行圖像分析。用目的基因與β－actin光密度的比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型制作結(jié)果 術(shù)后3 d，MI組與rhEPO治療組大鼠食欲低下，活動(dòng)量明顯減少，Sham組飲食行動(dòng)正常。第30天，MI組大鼠死亡4只，rhEPO治療組死亡1只，假手術(shù)對(duì)照組無死亡大鼠。

2.2 血清TNF－α表達(dá)含量變化 MI組的血清TNF－α表達(dá)為(46.95±18.69)pg/ml，與 Sham 組(19.42±6.25)pg/ml相比顯著升高(P＜0.05);與 MI組相比，rhEPO治療組(38.12±12.39)pg/ml的 TNF－α 表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。

2.3 RT－PCR結(jié)果 MI組大鼠心肌梗死區(qū)及周圍組織的TNF－α mRNA 和 β－actin mRNA 的光密度比值為(0.51±0.25)，與Sham組(0.22±0.01)相比顯著升高(P＜0.05);與 MI組相比，rhEPO治療組大鼠MI區(qū)及周圍組織的TNF－α mRNA和βactin mRNA的光密度比值(0.39±0.22)明顯降低。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織TNF-α mRNA表達(dá)

3 討論

MI后，將導(dǎo)致血供不足，最后造成有功能的心肌細(xì)胞減少以及心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致HF，而心肌細(xì)胞凋亡則是MI的重要特征之一〔8〕。EPO是一種含唾液酸的酸性糖蛋白激素，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，在以往血液透析病人的EPO治療中，發(fā)現(xiàn)長期應(yīng)用 EPO 可使病人體內(nèi)干擾素－γ(INF－γ)、TNF－α、白介素－6(IL－6)和白介素－8(IL－8)等致炎因子降低，而使抗炎因子白介素－10(IL－10)升高〔9〕，研究發(fā)現(xiàn)，促紅細(xì)胞生成素通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl－XL的表達(dá)而抑制促凋亡因子細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而阻止Apaf－1降解物與細(xì)胞色素C結(jié)合所誘導(dǎo)的促凋亡蛋白酶Caspase－9的活化，從而起抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用，保護(hù)血管內(nèi)皮〔10〕，另有研究發(fā)現(xiàn)，EPO能夠增加缺血處心肌細(xì)胞耐受缺氧的能力〔11〕，但是其具體的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

TNF－α在心室重塑中，能夠刺激心室肌成纖維細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞增生，促進(jìn)心肌膠原酶、蛋白酶的合成，使心室肌組織異常增生、肥大、纖維化導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死和HF，并調(diào)節(jié)膠原酶和C－jun基因的表達(dá)，NF－α能夠誘導(dǎo)C－jun基因的持續(xù)激活，通過其與活化蛋白－1(AP－1)位點(diǎn)的結(jié)合導(dǎo)致MMPs基因激活，使心肌與其他細(xì)胞中的MMPs明膠分解活性增強(qiáng)〔12〕，有研究報(bào)道，β受體阻滯劑可通過減少心肌細(xì)胞TNF－α等細(xì)胞因子的表達(dá)而改善左室重塑和心功能〔13〕，但是，rhEPO能否通過調(diào)節(jié)TNF－α的表達(dá)改善心臟功能尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

關(guān)于EPO保護(hù)缺血心肌的機(jī)制，目前爭論較多，EPO心臟保護(hù)作用的機(jī)制尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，rhEPO能夠很可能通過下調(diào)炎性因子TNF－α的表達(dá)來改善心臟功能，這個(gè)發(fā)現(xiàn)將為MI的藥物治療提供一定參考依據(jù)，

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R541.71

A

1005-9202(2015)09-2375-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.028

1 遼寧省人民醫(yī)院金秋醫(yī)院護(hù)理部

蔡長華(1958－)，男，主任醫(yī)師，主要從事心功能不全患者的藥物治療研究。

邢 軍(1976－)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心血管疾病的介入治療研究。

〔2014-03-13修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)