宮愛民 李鑫元 楊世忠 馮 釗 (海南醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?57000)

海南美登木提取物調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞凋亡基因p53、Fas和bcl-2的表達(dá)

宮愛民 李鑫元1楊世忠 馮 釗 (海南醫(yī)學(xué)院，海南 海口 571000)

目的 分析海南美登木提取物調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞凋亡基因p53、Fas和bcl-2的表達(dá)。方法 應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)及RT-PCR法分析海南美登木提取物作用后肝癌細(xì)胞中凋亡基因p53、Fas及細(xì)胞增殖基因bcl-2表達(dá)。結(jié)果 海南美登木提取物能對(duì)人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)和分化，并且能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成;細(xì)胞周期G0/G1期能夠有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;經(jīng)濃度為5、10 mg/L海南美登木對(duì)提取的癌細(xì)胞進(jìn)行24、36及72 h處理，可以發(fā)現(xiàn)很多野生型p53基因，但是未發(fā)現(xiàn)Fas及bcl-2基因。結(jié)論 海南美登木與患者體內(nèi)誘導(dǎo)野生型p53基因關(guān)系密切，它能夠有效清除患者體內(nèi)惡變細(xì)胞，提高患者身體功能。

海南美登木提取物;p53;bcl-2基因;凋亡

人體的造血、免疫和腫瘤發(fā)生機(jī)制都受細(xì)胞凋亡的影響。Fas屬于常見的腫瘤壞死因子(TNF)，它屬于轉(zhuǎn)移膜受體(TNF/NGF)超家族，當(dāng)這種因子受到抗體及配體等刺激時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)FasL死亡〔1〕。細(xì)胞在凋亡過程中p53與bcl-2基因都發(fā)揮重要作用。一方面，p53能夠有效地促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而bcl-2基因則能抑制細(xì)胞的凋亡〔2〕。美登木屬(Maytenus)植物主產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)〔3〕，海南美登木(M.Hainanensis)性辛、苦、溫，歸肝經(jīng)，具有活血消癥功效，是臨床上用于治療肝癌有效的海南民族中草藥，自20世紀(jì)70年代開始，相繼從美登木屬植物中分離提取到美登素、美登普林和美登布丁等抗腫瘤活性成分，并通過多年的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用，證明其抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物瘤譜廣、有效劑量低、安全系數(shù)大，臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明美登木屬植物可治療肝癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤〔4，5〕。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的凋亡有密切關(guān)系，通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡來治療各種惡性腫瘤是目前研究的熱點(diǎn)〔6〕。研究表明〔7〕:活血消癥中藥抗腫瘤作用亦多從凋亡途徑進(jìn)行深入研究。本研究選擇人肝癌HepG2細(xì)胞，觀察海南美登木含提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 藥材、主要儀器 海南美登木，產(chǎn)地海南，購自萬寧藥用植物研究所。光學(xué)成像顯微鏡 (上海光學(xué)儀器廠);超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)公司);MCO-17AICO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司);倒置顯微鏡 (上海光學(xué)儀器廠);酶標(biāo)儀(DG3022A日本產(chǎn));旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(DF-101S上海予正儀器設(shè)備有限公司);多功能細(xì)胞分析系統(tǒng)(Becton Dickinson FACSort美國(guó)產(chǎn));純水機(jī):深圳產(chǎn) SYJ-6HD400GHL;熒光顯微鏡 (德國(guó)Leica公司)。焦碳酸乙二脂(DEPC)，隨機(jī)引物(Oligo〔dT〕15引物)，脫氧核糖核酸酶抑制劑(RNasin)，脫氧核苷三磷酸(dNTP)均為 Promega產(chǎn)品，反轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV reverse transcriptase)為MBI fermentas產(chǎn)品，TaqDNA聚合酶(5 U)、PCR擴(kuò)增緩沖液為上海生工(Sangon)產(chǎn)品，內(nèi)切酶 HincⅡ?yàn)槿毡?TOYOBO)公司產(chǎn)品，PCR熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)，紫外光度儀(Amersham PharmaciaBiotech公司，Gene QuantTMⅡRNA/DNA Calculator型)。

1.2 引物序列 按文獻(xiàn)〔8〕及GenBank庫中p53基因序列設(shè)計(jì)了兩條引物:p1:5′-GGTCGACTGACACGCTTCCCTGGATTGG-3′，p2:5′-GGATCCTGCTTCTGACGCACACCTATTG-3′(295 bp)。按文獻(xiàn)〔1〕設(shè)計(jì)了 bcl-2及 Fas基因序列:bcl-2為 5′-GCGTCAACCGGGAGATGTCGCCC， 3′-TTTCTTAAACAGCCTGCAGCTTTG(348 bp);Fas 為 5′-GTACAGAAAACATGCAGAAAGCAC，3′-CTCTGCAAGAGTACAAAGATTGGC(342 bp)。

1.3 主要試劑 優(yōu)等胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、RPMI1640(美國(guó)Gibco公司);DMSO、MTT測(cè)定試劑盒 、Hoechst33258熒光染料 、碘化丙啶(美國(guó)Sigma公司);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(上海信然生物科技有限公司)等。

1.4 海南美登木提取物制備 用12、10、8倍量的水分別提取20 g藥物1.5、1、1 h，合并過濾后的濾液，加入 95% 乙醇，使乙醇含量達(dá)80%，棄去放置過夜的上清液，冷凍干燥所收集的沉淀，制成凍干粉〔9〕。

1.5 細(xì)胞株及培養(yǎng) 人源肝癌細(xì)胞HePG2，上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所贈(zèng)予;海南醫(yī)科大學(xué)病理生理實(shí)驗(yàn)室保存。實(shí)驗(yàn)中將10%滅活胎牛血清放在細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過程中放入100 mg/L青霉素以及100 mg/L鏈霉素，培養(yǎng)皿溫度控制在37℃，培養(yǎng)過程中每3 d更換一次液體。

1.6 藥物處理 用海南美登木提取物處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中藥物濃度分別設(shè)置為5、10 mg/L，并且設(shè)對(duì)照組，藥物在使用過程中對(duì)藥物進(jìn)行離心。

1.7 總RNA提取并反轉(zhuǎn)錄 對(duì)于細(xì)胞質(zhì)總RNA的提取參考文獻(xiàn)〔10〕。實(shí)驗(yàn)中搜集兩次PBS溶液，并且在200 μl RNA中提取緩沖液，并對(duì)這些緩沖液進(jìn)行離心，舍去未分裂的細(xì)胞和細(xì)胞下層的沉淀物，而離心上層則使用50 mg/L的蛋白酶K，溫度控制在37℃，時(shí)間控制在30 min。然后，向分離的液體中加入1體積的水飽和酚和0.2體積的氯仿:異或醇(24∶1)對(duì)所得的液體再次進(jìn)行離心，讓其沉淀RNA，并在溫度為-20℃下放置至少1 h，用70%的乙醇洗一遍，真空干燥并用DEPC水重溶RNA。向20 μl的反轉(zhuǎn)錄緩沖液中加 2 μl單鏈〔dT〕15引物，2.5 μl dNTP(各 10 mmol/L)，0.5 μl RNasin(1 000 U/ml)，然后，70℃加熱5 min，冰上冷卻。簡(jiǎn)短離心后加 1.2 μl Moloney MuLV病毒反轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO公司)并37℃下保溫1 h，90℃變性5 min，得到的cDNA樣品保存于-70℃。

1.8 PCR的擴(kuò)增 采用0.2 ml的基因中共包含以下成分，即:2.5 μl cDNA，50 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L 5′→3′核苷酸引物及2.5 U Taq酶(Sangon)。PCR 反應(yīng)時(shí)共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，并且在94℃時(shí)保持30 s，每一個(gè)引物退火后控制在72℃中保持2 min。對(duì)于PCR的產(chǎn)物在檢測(cè)過程中可以使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并且設(shè)對(duì)照組。

2 結(jié)果

海南美登木提取物能夠?qū)θ梭w內(nèi)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)和分化，并且能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示:從細(xì)胞周期的G0/G1期能夠有效地誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，實(shí)驗(yàn)過程中可以采用濃度為5 mg/L、10 mg/L的海南美登木處理癌細(xì)胞，對(duì)樣本進(jìn)行24 h、36 h及72 h檢查，結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)很多野生型 p53 基因(Fig.1:4、7 號(hào)泳道，F(xiàn)ig.2:2、3、4、5 號(hào)泳道)，但是卻并沒有發(fā)現(xiàn) Fas及 bcl-2 等基因(Fig.1:2、3、4、5、6 號(hào)泳道，F(xiàn)ig.2:6、7、8、9、10、11、12、13 號(hào)泳道)。見圖 1，圖 2。

圖1 RT-PCR分析肝癌細(xì)胞中p53，bcl-2與Fas mRNA水平(24 h)

圖2 RT-PCR分析肝癌細(xì)胞中p53，bcl-2與Fas mRNA 水平(36，72 h)

3 討論

p53基因是臨床上研究較多的抑制基因，和腫瘤等有著緊密的聯(lián)系。野生型p53是典型的抗腫瘤基因，但是這種物質(zhì)的突變型則不但不會(huì)抑制腫瘤的發(fā)生，甚至?xí)龠M(jìn)腫瘤生長(zhǎng)而變?yōu)榘┗颉?，11，12〕。醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為:p53基因是癌癥患者中比較常見的突變基因。肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)并檢測(cè)出了p53基因，并發(fā)現(xiàn)了一種新型基因bcl-2，該基因表達(dá)能力較強(qiáng)，能夠誘發(fā)腫瘤，并且能夠準(zhǔn)確計(jì)算出腫瘤細(xì)胞的生存期〔13，14〕。

海南美登木活血化瘀，含抗癌活性成分的美登木素和美登布林有直接殺死癌細(xì)胞的作用。根據(jù)過去相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:海南美登木后藥物能夠?qū)颊呙庖咂鸬秸{(diào)節(jié)作用，能夠保護(hù)患者肝臟，且藥物能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞加速分化，對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA的合成等具有較強(qiáng)的抑制作用。并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示:海南美登木從細(xì)胞周期的G0/G1期開始誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。從這些實(shí)驗(yàn)等中都可以看出海南美登木提取物的作用機(jī)制和在腫瘤患者體內(nèi)發(fā)揮的作用〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在腫瘤細(xì)胞凋亡過程中，基因p53表達(dá)能力會(huì)增強(qiáng)。但是在細(xì)胞分化和增殖過程中bcl-2等基因卻沒有得到表達(dá)。海南美登木提取物在p53基因中能夠有效清除患者體內(nèi)的癌細(xì)胞，增強(qiáng)患者機(jī)體免疫，但是相關(guān)機(jī)制仍然需要研究。

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R73

A

1005-9202(2015)09-2370-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.026

海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.811205;811207)

1 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)

楊世忠(1952-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療肝膽病研究。

宮愛民(1975-)，男，主任醫(yī)師，博士，主要從事中醫(yī)四診客觀化、肝膽病研究。

〔2013-12-16修回〕

(編輯 苑云杰)