李曉清 安 琳 鐘家芳 (重慶市中醫(yī)院腫瘤科，重慶 4000)

益氣除痰方對(duì)大鼠肺癌A549細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制

李曉清 安 琳1鐘家芳2(重慶市中醫(yī)院腫瘤科，重慶 400021)

目的 探討益氣除痰方對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制作用及與細(xì)胞凋亡相關(guān)的機(jī)制。方法 以四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法和流式細(xì)胞術(shù)碘化丙啶(PI)單染法檢測(cè)益氣除痰方對(duì)肺癌A549細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率的影響，RT－PCR方法檢測(cè)p53、bcl－2和bax的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果

MTT法檢測(cè)結(jié)果表明益氣除痰方顯著抑制A549細(xì)胞的生長(P＜0.05或P＜0.01)，抑制作用隨藥物作用時(shí)間和濃度增大而增大;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明益氣除痰方對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用隨著藥物劑量的增加而顯著增大(P＜0.05);RT－PCR結(jié)果顯示與對(duì)照組(p53基因1.58±0.91、bax基因3.27±1.55和bcl－2基因12.09±2.67)相比，益氣除痰方引起p53和bax的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(p53和bax分別為13.89±2.52和12.83±1.95，P均＜0.01)，但bcl－2的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(9.86±2.12，P＜0.05)。結(jié)論 益氣除痰方可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡，具有抑制其生長的作用，這可能與p53和bax表達(dá)上調(diào)、bcl－2表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

益氣除痰方;A549細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

近年來，如何調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)而影響癌癥的變化已成為國內(nèi)外研究者重要研究方向之一〔1～3〕，而中藥日益成為臨床治療癌癥的重要選用藥物。由不同藥材按比例調(diào)和而成的中藥配方，如益氣除痰湯，在臨床上治療肺癌具有良好的效果〔4，5〕。研究表明，益氣除痰方能降低過氧化物還原酶(PRDX)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等基因的表達(dá)，可抑制腫瘤的發(fā)展〔5，6〕。益氣除痰方對(duì)肺癌的抑制機(jī)制涉及細(xì)胞生長過程及不同基因的表達(dá)調(diào)控，然而相關(guān)研究報(bào)道較缺乏。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定益氣除痰方處理后肺癌A549細(xì)胞的生長活力，及凋亡相關(guān)基因(p53、bcl－2和bax)的變化，以期為益氣除痰方在臨床上應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)用肺癌A549細(xì)胞由大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 材料 SD雌性大鼠，體重160～250 g，SPF級(jí)，由大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科動(dòng)物中心提供。

試劑:①胎牛血清和碘化丙啶(PI)(北京索萊寶科技有限公司);②RPMI－1640完全培養(yǎng)基(美國Gibco公司);③四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司);④瓊脂糖(美國Promega公司);⑤DNA marker(美國Promega公司)。

儀器:①Synergy 2多功能酶標(biāo)儀(美國Biotek公司);②SHELLAB CO2培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司);③Stratedigm流式細(xì)胞儀(美國Stratedigm公司);④Biometra梯度PCR儀(德國Biometra公司);⑤DYY－2C電泳儀(北京市六一儀器廠);⑥BioSpectrum－UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.3 含藥血清的制備 益氣除痰方包括法夏、五爪龍、枳實(shí)、人參、黨參、白術(shù)、茯苓和露蜂房，按照比例 2 ∶5∶1 ∶2 ∶3 ∶3 ∶1將各藥材混合粉碎，留取30目過篩后的樣品煎煮成湯劑。60℃濃縮制成的藥物含量為2.0 g/ml，藥物分裝后－20℃儲(chǔ)存。

大鼠30只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。分別以益氣除痰方湯劑和生理鹽水對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠進(jìn)行灌胃，每次50 ml/kg，每日早晚各1次，持續(xù)5 d。灌胃4 d后對(duì)大鼠進(jìn)行饑餓處理，并在第5天給藥結(jié)束1 h后從心臟抽血，置于4℃靜置12 h。血樣4℃、800 r/min離心20 min，收集上清液并置于56℃水浴30 min。滅活后的血清經(jīng)濾膜除菌后置于EP管中，然后轉(zhuǎn)入－80℃保存。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)液包括胎牛血清10%(V/V)、青霉素和鏈霉素(各100 U/ml)。取細(xì)胞懸液，經(jīng)RPMI－1640培養(yǎng)液稀釋至適當(dāng)濃度后，將其接種于96孔培養(yǎng)板(3 000個(gè)細(xì)胞/孔)。培養(yǎng)條件:溫度 37℃、5%CO2和濕度60%。

1.5 細(xì)胞活力檢測(cè) 待培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，棄原培養(yǎng)液，加入含不同濃度血清的培養(yǎng)液進(jìn)行處理，其中對(duì)照組加入30%胎牛血清(V/V)培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入含藥血清(0% ～30%)培養(yǎng)液。每組包括5個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組設(shè)0%、5%、15%、25%和30%含藥血清5個(gè)梯度，按照比例RPMI－1640培養(yǎng)液(無藥血清+含藥血清)=7∶3配制而成。各組分別于培養(yǎng)24、48和72 h后加入20 μl MTT 溶液(0.5%)，37℃ 孵育 4 h，棄上清后加入 100 μl DMSO。室溫黑暗條件下持續(xù)振蕩20 min后，490 nm測(cè)定各組OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定4次。細(xì)胞活力(P，%)=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期后，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化。計(jì)數(shù)細(xì)胞后，將其接種于培養(yǎng)板中(10萬個(gè)/孔)。待細(xì)胞貼壁生長后，加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使其生長同步。棄原培養(yǎng)液，對(duì)照組加入無藥血清培養(yǎng)液，而實(shí)驗(yàn)組加入含藥血清(10%和20%)培養(yǎng)液。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，獲得的細(xì)胞以冰冷乙醇(75%)固定。PI染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(%Tot，即G0期細(xì)胞所占百分比)。不同濃度梯度的培養(yǎng)液是按照比例RPMI－1640培養(yǎng)液∶(無藥血清+含藥血清)=8∶2配制而成。

1.7 凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá) 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，分別加入無藥血清和20%含藥血清培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取適量樣品加入TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA，并測(cè)定提取的RNA含量(A260)和純度(A260/A280)。取1 μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后加入合成的引物進(jìn)行擴(kuò)增。各引物序列:p53正義:5′－AGTGTGGTGGTGCCCTATGAG－3′，反 義:5′－TTTGGACTTCAGGTGGCTGGA－3′;bcl－2 正 義:5′－TCAACACAGACCCACCAGAG－3′， 反 義:5′－AACCCCACAGCAAAAGGCAG－3′;bax 正 義:5′－TGAACAGGAGATTGGGAGTCTG－3′，反義:5′－TTGATCTGGGTCTTGGCTCG－3′;GAPDH(內(nèi) 參)正 義:5′－ATCACTGCCACCCAGAAGACT－3′，反 義:5′－CATGCCAGAGGTCGGTTCGTTT－3′。PCR 設(shè)置條件:94℃ 預(yù)變性4 min;各基因循環(huán)條件均為94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s(均包含28個(gè)循環(huán));72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測(cè)定。UVP凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同處理肺癌細(xì)胞活力比較 0%組(即無藥血清)與對(duì)照組在24、48、72 h差異均不顯著(P＞0.05)。5%和15%含藥血清組處理48、72 h細(xì)胞活性與對(duì)照組相比受到顯著抑制(P＜0.05或P＜0.01)，而25%和30%含藥血清對(duì)肺癌A549細(xì)胞活性抑制作用達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。見表1。

表1 不同處理組肺癌A549細(xì)胞活性(±s，n=5)

表1 不同處理組肺癌A549細(xì)胞活性(±s，n=5)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別24 h 48 h 96 h對(duì)照組99.92±1.51 100.12±5.23 100.87±6.72 0% 100.33±2.05 99.05±2.36 98.35±5.21 5% 101.26±3.11 95.58±2.671) 91.13±6.172)15% 98.76±1.89 87.43±3.132) 83.56±4.622)25% 95.12±1.482) 78.25±2.062) 75.23±5.332)30% 91.70±3.972) 75.37±2.052) 74.35±5.282)

2.2 不同處理肺癌細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組凋亡率為(2.25±0.35)%，而10%和20%含藥血清組分別為(7.83±0.71)%和(13.06±0.58)%，與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05)。

2.3 肺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平 對(duì)照組p53、bax、bcl－2 mRNA 水平分別為 1.58±0.91、3.27±1.55、12.09±2.67。20%含藥血清處理48 h后，p53和bax基因表達(dá)上調(diào)(13.89±2.52、12.83±1.95)，而 bcl－2 基因表達(dá)下調(diào)(9.86±2.12)，與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)，見圖1。

圖1 兩組肺癌A549細(xì)胞p53、bax和bcl-2 mRNA表達(dá)

3 討論

細(xì)胞凋亡不僅與細(xì)胞色素等物質(zhì)的變化有關(guān)，而且受到某些基因表達(dá)的調(diào)控。其中，p53和bcl－2是近年來研究較多的兩大家族。p53表達(dá)上調(diào)可抑制細(xì)胞分裂并誘發(fā)細(xì)胞凋亡，從而對(duì)腫瘤的變化產(chǎn)生重大抑制作用〔7〕。bcl－2和 bax同屬bcl－2家族，但二者mRNA表達(dá)水平在本研究中呈相反變化:前者表達(dá)下調(diào)，而后者表達(dá)上調(diào)。這種變化與二者在細(xì)胞凋亡過程中的功能不同有關(guān):其中 bcl－2具有抑制作用，bax具有促進(jìn)作用〔8，9〕，內(nèi)源或外源脅迫均可刺激這兩種基因的表達(dá)〔10，11〕。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組肺癌A549細(xì)胞的活力降低，生長受到抑制。但這種抑制作用在藥物濃度較低(5% ～15%)時(shí)需較長時(shí)間(48 h)才得以顯現(xiàn)，而在藥物濃度較高(25% ～30%)時(shí)所需時(shí)間較短(24 h)，且后者抑制作用更大。同時(shí)處理后的細(xì)胞凋亡率顯著增大，且隨藥物劑量增大而增大。研究發(fā)現(xiàn)，p53和bcl－2家族在肺癌細(xì)胞凋亡過程中亦發(fā)揮了重要作用〔11～13〕。在本研究中，益氣除痰方處理后，p53在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)，其可抑制參與肺癌細(xì)胞分裂有關(guān)酶的活性〔7〕。Bcl－2 家族功能的發(fā)揮與膜結(jié)構(gòu)的完整性密切相關(guān)〔14〕，本研究表明益氣除痰方可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族的表達(dá)〔6〕，從而降低胞外基質(zhì)的降解〔15〕，有利于 bcl－2 家族功能的發(fā)揮。結(jié)果顯示，益氣除痰方處理后，肺癌細(xì)胞凋亡率顯著升高，這可能與bax/bcl－2比例增加有關(guān)。因此，益氣除痰方對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，可能是正常細(xì)胞周期受到破壞和多種因素誘發(fā)細(xì)胞凋亡率升高的共同作用結(jié)果。

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R56

A

1005-9202(2015)09-2365-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.024

重慶市自然科學(xué)基金資助(cstc2014jcyjA0756)

1 重慶市中醫(yī)院內(nèi)分泌科 2 成都市第五人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)二病區(qū)第一作者:李曉清(1981－)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤的基礎(chǔ)及臨床研究。

〔2014－05－11 修回〕

(編輯 徐 杰)