徐 冰 張一兵 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

慢性阻塞性肺病大鼠血紅素加氧酶-1表達(dá)及其臨床意義

徐 冰 張一兵 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

目的 探討血紅素加氧酶(HO)-1在慢性阻塞性肺病(COPD)大鼠肺組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 Wistar健康雄性大鼠60只隨機(jī)分為模型組、藥物干預(yù)組、生理鹽水對(duì)照組各10只，分別給予煙熏配合脂多糖造模，煙熏配合脂多糖造模+大蒜素6.17 mg/kg灌胃，正常喂養(yǎng)等干預(yù)措施，5 w后進(jìn)行肺功能測(cè)定，包括動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)、氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)。同時(shí)光鏡下觀察肺臟的形態(tài)，采用RT-PCR法檢測(cè)各組HO-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與生理鹽水對(duì)照組比較，模型組3 s用力呼氣容積(FEV)3.0/用力肺活量(FVC)、呼氣峰流速(PEF)、PaO2、PaO2/FiO2、HO-1 蛋白及基因表達(dá)下降顯著(P＜0.01)，PaCO2升高顯著(P＜0.01)。與模型組比較，藥物干預(yù)組 FEV3.0/FVC、PEF、PaO2、PaO2/FiO2、HO-1蛋白及基因表達(dá)升高顯著(P＜0.01)，PaCO2下降顯著(P＜0.01)。各組光鏡下肝臟顯示:生理鹽水對(duì)照組肺結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張，部分支氣管旁間質(zhì)存在少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);模型組肺組織結(jié)構(gòu)模糊，肺泡間毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯并伴有出血，見(jiàn)大小不一凝固性肺壞死灶;藥物干預(yù)組肺組織結(jié)構(gòu)尚清，少量毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔內(nèi)存在少許水腫液。結(jié)論 HO-1可能在COPD的發(fā)病過(guò)程中起保護(hù)作用，大蒜素改善COPD大鼠肺功能結(jié)構(gòu)。

血紅素加氧酶;慢性阻塞性肺病(COPD);大蒜素;mRNA表達(dá)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)發(fā)病機(jī)制的研究主要包括蛋白酶/抗蛋白酶失衡學(xué)說(shuō)、炎癥學(xué)說(shuō)、氧化抗氧化失衡學(xué)說(shuō)，關(guān)于蛋白酶/抗蛋白酶失衡學(xué)說(shuō)和炎癥學(xué)說(shuō)已有較多研究。隨著近期環(huán)境污染、霧霾及機(jī)體反應(yīng)氧化物質(zhì)的增多，氧化抗氧化失衡學(xué)說(shuō)已受到重視。血紅素加氧酶(HO)-1是一種最廣泛存在的抗氧化防御酶，具有抗炎、抗氧化損傷、抗凋亡、抗增生的生理功能，可被多種刺激因素所誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的表達(dá)，如熱休克、重金屬、內(nèi)毒素、血紅素、細(xì)胞因子、紫外線等〔1，2〕。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從基因及蛋白兩方面水平研究HO-1在COPD大鼠肺組織中的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1 主要儀器 LEICA CM1850冰凍切片機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman公司)，XD711酶標(biāo)儀(美國(guó)Beckman公司)，小動(dòng)物肺功能測(cè)定系統(tǒng)(美國(guó)Beckman公司)，PHYⅢ型病理組織漂烘處理儀(冷泉港生物科技股份有限公司)，電熱自動(dòng)恒溫水溫箱(上海醫(yī)療器械廠)等。

1.2 主要試劑 SP免疫組化試劑盒(PV-6001)購(gòu)自北京中杉生物試劑公司;DAB增強(qiáng)性顯色試劑盒(ZL19032)購(gòu)自北京中杉生物試劑公司;HO-1酶聯(lián)免疫試劑盒(hemin)和牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma公司;大鼠HO-1 ELISA試劑盒和 HO-1 ELISA試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

1.3 COPD動(dòng)物模型制備 健康Wistar健康雄性大鼠60只(由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)，SPF級(jí)別，體重(230±18)g。隨機(jī)分為模型組20只，給予煙熏配合脂多糖(LPS，美國(guó)Sigma公司)處理〔3〕，第 1、15 天氣管內(nèi)滴入 LPS 200 μg，其余時(shí)間煙熏2次/d，每次60 min，共5 w;藥物干預(yù)組20只，煙熏配合LPS造模后于第16天給予大蒜素，每天按體重6.17 mg/kg灌胃;生理鹽水對(duì)照組20只，第1、15天氣管內(nèi)滴入無(wú)菌注射用水0.2 ml，其余時(shí)間正常條件下飼養(yǎng)。

1.4 肺功能測(cè)定 5 w后，測(cè)定3 s用力呼氣容積占用力肺活量的比值(FEV3.0/FVC)和呼氣峰流速(PEF)。末日熏吸香煙后用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，取仰臥位，測(cè)定動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)、氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)〔3〕。

1.5 光鏡下觀察肺臟的形態(tài) 組織取材→固定→沖洗→脫水→透明→浸蠟→組織包埋→組織切片→展片附貼→切片脫蠟→染色→脫水→染片透明→封固→SP免疫組化→光鏡下觀察肺臟的形態(tài)，采用大鼠HO-1試劑盒用ELISA方法檢測(cè)HO-1的蛋白表達(dá)。

1.6 RT-PCR法檢測(cè)HO-1 mRNA的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×104個(gè)/ml接種于6孔板。培養(yǎng)12 h后，每孔加入1 ml Trizol提取總RNA，測(cè)RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。定量PC R 程序:起始95℃解鏈 5 min，擴(kuò)增程序?yàn)?95℃15 s，60℃15 s，72℃50 s，共40個(gè)循環(huán)。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因，所使用的引物見(jiàn)表1。

表1RT-PCR所用引物

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果 與生理鹽水對(duì)照組比較，模型組 FEV3.0/FVC、PEF、PaO2、PaO2/FiO2下降顯著(P＜0.01)，PaCO2升高顯著(P＜0.01)。與模型組比較，藥物干預(yù)組FEV3.0/FVC、PEF、PaO2，PaO2/FiO2升高顯著 (P ＜0.01)，PaCO2下降顯著(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果(±s，n=20)

表2 各組動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果(±s，n=20)

與生理鹽水對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

組別 FEV3.0/FVC(%) PEF(ml/s) PaO2(mmHg) PaCO2(mmHg) PaO2/FiO2生理鹽水對(duì)照組 75.6±12.0 42.8±7.6 90.2±12.0 38.6±8.2 432.1±20.3模型組 54.0±9.21) 24.6±4.41) 55.2±11.61) 61.4±5.51) 255.9±34.01)藥物干預(yù)組 62.3±5.92) 29.5±8.22) 88.7±10.32) 40.0±6.72) 422.5±32.72)

2.2 肺組織光鏡學(xué)檢查 生理鹽水對(duì)照組肺結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張，部分支氣管旁間質(zhì)存在少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肺組織結(jié)構(gòu)模糊，肺泡間毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯并伴有出血，同時(shí)可見(jiàn)大小不一凝固性肺壞死灶的存在。藥物干預(yù)組肺組織結(jié)構(gòu)尚清，肺泡間隔內(nèi)少量毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡腔內(nèi)存在少許水腫液。見(jiàn)圖1。

圖1 各組肺組織光鏡學(xué)檢查(HE染色，×40)

2.3 各組肺組織HO-1蛋白和mRNA表達(dá) 與生理鹽水對(duì)照組(5.06±0.05)比較，模型組 HO-1 蛋白表達(dá)(3.31±0.03)下降顯著(P＜0.01)。與模型組比較，藥物干預(yù)組HO-1蛋白表達(dá)(5.01±0.01)升高顯著(P＜0.01)。各組 HO-1 mRNA 表達(dá)亦然，見(jiàn)圖2。

圖2 各組肺組織HO-1 mRNA表達(dá)

3 討論

HO-1是一種存在于微粒體中氧化還原酶，是一種催化血紅素降解為一氧化碳、鐵和膽紅素的起始酶及限速酶，生物學(xué)功能較為明顯〔4〕，屬于抗氧化防御酶，被認(rèn)為是細(xì)胞應(yīng)激的主要敏感指標(biāo)之〔2，3〕。血紅素降解過(guò)程是一系列自身催化的氧化反應(yīng)過(guò)程。該過(guò)程需要NADPH-細(xì)胞色素P-450還原酶和分子氧的參與。它作用于血紅素的α-亞甲基橋，在許多生理和病理過(guò)程中起到重要調(diào)節(jié)作用。

氧化/抗氧化失衡是COPD的主要發(fā)病機(jī)制之一〔5〕。近期報(bào)道顯示，誘導(dǎo)HO-1的產(chǎn)生是機(jī)體氧化應(yīng)激的標(biāo)識(shí)，通過(guò)HO-1作用產(chǎn)生的膽色素比維生素E的抗氧化作用更強(qiáng)，因此推測(cè)HO-1所催化的反應(yīng)是機(jī)體對(duì)氧化應(yīng)激的一種反應(yīng)，以此來(lái)達(dá)到對(duì)細(xì)胞的保護(hù)。吸煙者HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)不足可能會(huì)增加患COPD的風(fēng)險(xiǎn)。Shinohara等〔6〕證實(shí)通過(guò)腺病毒基因轉(zhuǎn)染的大鼠使HO-1表達(dá)增加，能夠改善胰彈性蛋白酶導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)、促炎癥因子的生成和擴(kuò)大氣道，進(jìn)一步表明HO-1在COPD發(fā)病中的作用。吸煙時(shí)煙霧能增加肺泡巨噬細(xì)胞HO-1的表達(dá)〔7，8〕。據(jù) Matsumoto等〔9〕及 Li等〔10〕發(fā)現(xiàn)，HO-1 在 COPD 患者中的抗氧化調(diào)節(jié)作用可能發(fā)生的機(jī)制為:外源性的氧化劑導(dǎo)致機(jī)體氧化/抗氧化失衡，升高 HO-1水平。報(bào)道顯示〔11〕，HO-1基因的多態(tài)性與肺氣腫易感性息息相關(guān)。Shinohara等〔6〕發(fā)現(xiàn)，大鼠肺組織腺病毒介導(dǎo)的HO-1 cDNA轉(zhuǎn)染降低彈力蛋白所致的肺氣腫程度。Yamada等〔11〕證明HO-1基因的多態(tài)性與肺氣腫易感性關(guān)系密切。本研究結(jié)果提示HO-1可能在COPD的發(fā)病過(guò)程中起保護(hù)作用，與上述研究結(jié)果較為一致。大蒜素是大蒜中提取得到的，有報(bào)道指出，作為天然的廣譜抗生素，大蒜素能夠利用捕獲自由基來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)多種抗氧化酶的表達(dá)水平〔12〕。使用大蒜素作用肺泡上皮細(xì)胞6 h后，能升高細(xì)胞內(nèi)的γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(GCS)的表達(dá)水平〔13〕，提示大蒜素作用后細(xì)胞內(nèi)的谷胱苷肽(GSH)含量增加可能與γ-GCS關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)提示大蒜素可能通過(guò)HO-1來(lái)增加γ-GCS的表達(dá)來(lái)改善COPD。

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R541.61

A

1005-9202(2015)09-2353-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.019

遼寧省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013225305)

張一兵(1961-)，男，碩士，教授，主任檢驗(yàn)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事臨床內(nèi)科疾病研究。

徐 冰(1974-)，女，在讀碩士，主治醫(yī)師，主要從事臨床內(nèi)科疾病研究。

〔2013-12-21修回〕

(編輯 苑云杰)