趙 敏 李 炯 宋曉冬 呂長俊 (濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，山東 煙臺 264003)

肺復(fù)康合劑對大鼠肺纖維化的抑制作用及相關(guān)機(jī)制

趙 敏 李 炯 宋曉冬 呂長俊 (濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，山東 煙臺 264003)

目的 探討肺復(fù)康合劑對大鼠肺纖維化的抑制作用及相關(guān)機(jī)制。方法 40只SD雄性大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、造模+肺復(fù)康組、單純肺復(fù)康組。模型組、造模+肺復(fù)康組氣管灌注博萊霉素(5 mg/kg)，而對照組和單純肺復(fù)康組氣管灌注同等劑量無菌生理鹽水，隨后對照組和模型組生理鹽水灌胃28 d，造模+肺復(fù)康組、單純肺復(fù)康組肺復(fù)康合劑灌胃(12 ml/kg)28 d。給藥28 d后麻醉處死，計算各組肺系數(shù)、肺干重/體重變化，檢測肺組織羥脯氨酸(HYP)、一氧化氮(NO)、肺動脈血漿NO2-/NO3-含量、丙二醛(MDA)水平，以及Western印跡法檢測誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)表達(dá)水平。結(jié)果 與對照組相比，模型組肺系數(shù)、肺干重/體重、HYP、NO、NO2-/NO3-、MDA、iNOS、CTGF、p-ERK 表達(dá)均明顯增高(P＜0.05);與模型組相比，造模+肺復(fù)康組肺系數(shù)、肺干重/體重、HYP、NO、NO2-/NO3-、MDA、iNOS、CTGF、p-ERK表達(dá)水平均明顯降低，肺纖維化指標(biāo)均明顯改善;單純肺復(fù)康組與對照組相比，上述指標(biāo)沒有明顯變化(P＞0.05)。結(jié)論 肺復(fù)康合劑通過抑制促纖維化因子iNOS、CTGF表達(dá)及ERK信號通路，減少博萊霉素所致的應(yīng)激損傷、病理變化、膠原合成，發(fā)揮抑制肺纖維化的藥理作用。

肺復(fù)康合劑;肺纖維化;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶;結(jié)締組織生長因子;磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶

肺纖維化病理變化以肺成纖維細(xì)胞彌漫性增生為主，進(jìn)行性積聚的基質(zhì)膠原逐步取代正常肺組織。目前，還沒有特效的治療方法〔1〕。近年來研究表明，在肺纖維化及纖維化多器官損傷中，氧化應(yīng)激發(fā)揮關(guān)鍵性作用〔2〕。在肺纖維化演變過程中，誘導(dǎo)型一氧化氮(NO)合酶(iNOS)表達(dá)增多能夠加速NO的合成〔3〕。CCN2作為CCN家族成員之一，也稱為結(jié)締組織生長因子(CTGF)，不僅是纖維化疾病預(yù)后的重要評估指標(biāo)，還為潛在抗纖維化治療提供新的方向〔4〕。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的亞族，能夠激活多種生長因子及細(xì)胞因子。有報道稱，博萊霉素(BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化模型中，ERK活性明顯增高〔5〕。肺復(fù)康合劑能夠抑制成纖維細(xì)胞增殖，抑制肺纖維化，肺復(fù)康合劑劑量(1 g/ml)已證實是抑制BLM誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的最佳濃度〔6〕，本研究擬觀察肺復(fù)康合劑對大鼠肺纖維化的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物與試劑 雄性SD大鼠40只，體重(200±15)g，購自山東綠葉制藥有限公司實驗動物中心;BLM產(chǎn)自日本華藥株式會社高崎制藥廠;肺復(fù)康合劑由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室提供，黃芪 30 g、丹參30 g、魚腥草30 g、地龍30 g、川芎10 g、甘草10 g，水煎煮2次，1 h/次，合并煎液，靜置沉淀，濾過，濃縮至所需濃度(含生藥1 g/ml);羥脯氨酸(HYP)、NO試劑盒購自武漢博士德生物工程股份有限公司、NO2-/NO3-試劑盒及丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物有限公司。iNOS(1∶1 000稀釋)，CTGF(1∶1 000 稀釋)，ERK1，2(1∶1 000 稀釋，兔多克隆抗體)、p-ERK(1∶1 000稀釋，小鼠單克隆抗體)，購自 Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗(1∶5 000稀釋)、硝酸纖維素膜(PVDF)，購自北京中山金橋生物有限公司;免疫組化試劑盒(SABC試劑盒)購自武漢博士德生物工程公司。

1.2 分組與造模 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法，將40只大鼠分為對照組、模型組、模型+肺復(fù)康組、單純肺復(fù)康組，10只/組。水合氯醛麻醉后，仰臥位，逐層切開頸部組織，鈍性分離，充分暴露氣管，于氣管環(huán)狀軟骨間隙穿刺，注入BLM或生理鹽水溶液，注射完畢后立即將動物直立旋轉(zhuǎn)，促進(jìn)藥液充分作用于肺部組織，逐層縫合。模型組、造模+肺復(fù)康組氣管灌注博萊霉素(5 mg/kg)，對照組和單純肺復(fù)康組氣管灌注同等劑量無菌生理鹽水。造模后，對照組和模型組生理鹽水灌胃28 d，模型+肺復(fù)康組、單純肺復(fù)康組予肺復(fù)康合劑(濃度為12 ml/kg)灌胃28 d。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 肺系數(shù) 大鼠灌胃28 d后，稱重作為終末體重，10%水合氯醛麻醉處死(350 mg/kg)，取出肺臟組織，稱重。肺系數(shù)=肺臟重量/終末體重。定量稱量0.5 g肺組織勻漿，經(jīng)氯仿、甲醇(2∶1)混合液、乙醇、丙酮脫水、脫脂后干燥，研磨成粉末，準(zhǔn)確稱量肺粉，根據(jù)肺干濕重比例換算成肺干重。

1.3.2 病理組織觀察 動物處死后，取出、修剪肺組織，將部分肺組織固定于10%甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS)，室溫7 d，梯度乙醇脫水、石蠟包埋后，切成5 μm厚度切片，蘇木精-伊紅染色、Masson三聯(lián)染色，光學(xué)顯微鏡觀察肺臟的組織病理學(xué)變化。

1.3.3 肺組織HYP、NO水平 動物處死后，將肺組織切塊，部分浸入0.9%生理鹽水，制備肺組織勻漿，通過相應(yīng)試劑盒，按照操作說明，檢測HYP、NO水平。

1.3.4 肺動脈血漿NO2-/NO3-、MDA含量 各組大鼠在灌注28 d后，10%水合氯醛麻醉(350 mg/kg)，取肺動脈血，通過NO2-/NO3-試劑盒、MDA試劑盒，測定肺動脈血漿 NO2-/NO3-、MDA含量。

1.3.5 iNOS、CTGF(CCN2)、p-ERK 表達(dá) 動物處死后，將肺組織切塊，加入 0.3 ml冰組織裂解液(Tris-HCl，pH7.5，0.5 mol/L，NaCl 0.15 mol/L、EDTA 0.001 mol/L、Aprotinin 2 μg/ml、PMSF 0.001 mol/L)，裂解 15 min 組織勻漿，離心15 min(12 000 r/min，4℃)，取上清液，－80℃保存。通過酚試劑法檢測蛋白濃度。每孔取50 μg總蛋白，加入等體積上樣緩沖液，煮沸10 min后，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠50 V、分離膠100 V)，4℃恒流60 mA轉(zhuǎn)膜，過夜，5%胎牛血清蛋白(BSA)漂洗液封閉1 h，加入一抗，室溫孵育2 h，搖床緩慢搖動，漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗，室溫孵育1 h，漂洗后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。凝膠圖像分析軟件掃描，檢測蛋白條帶表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件，計量資料以±s表示，兩兩比較采用單因素方差分析及LSD法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組肺系數(shù)、肺干重/體重比較 與對照組相比，模型組的肺系數(shù)、肺干重/體重均明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，造模+肺復(fù)康組的肺系數(shù)、肺干重/體重均顯著降低(P＜0.05);而單純肺復(fù)康組與對照組相比，肺系數(shù)、肺干重/體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組肺系數(shù)、肺干重/體重、HYP、NO、NO2-/NO3-、MDA水平比較(±s)

表1 各組肺系數(shù)、肺干重/體重、HYP、NO、NO2-/NO3-、MDA水平比較(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n 肺系數(shù)(g/kg) 肺干重/體重(g/kg) HYP(mg/g) NO(μmol/g) NO2-/NO3-(μmol/L)MDA(μmol/L)8.0±0.7模型組 10 8.1±0.61) 2.2±0.31) 1.3±0.11) 2.36±0.241) 156.9±17.21) 13.8±2.91)造模+肺復(fù)康組 10 5.6±0.51)2) 1.4±0.31)2) 1.0±0.11)2) 1.43±0.191)2) 79.3±14.21)2) 10.5±1.61)2)單純肺復(fù)康組 10 4.3±0.42) 0.9±0.22) 0.8±0.12) 0.10±0.132) 52.8±10.12) 8.7±1.02)對照組 10 4.1±0.5 0.8±0.2 0.8±0.1 0.98±0.17 52.3±8.7

2.2 各組肺組織病理變化 對照組大鼠各時間點肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁無充血、水腫，肺泡腔無出血，未見纖維化組織。模型組大鼠肺組織正常肺泡結(jié)構(gòu)破壞，廣泛性肺泡間隔增寬，淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞密集性間質(zhì)浸潤。與模型組相比，造模+肺復(fù)康組肺組織形態(tài)學(xué)變化有了明顯改善，細(xì)胞內(nèi)浸潤明顯減少，肺泡間隔明顯變窄。而對照組和單純肺復(fù)康組沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化(圖1)。Masson染色后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組出現(xiàn)明顯的膠原蛋白沉積、肺形態(tài)扭曲。與模型組相比，造模+肺復(fù)康組明顯抑制膠原蛋白沉積的程度及強(qiáng)度。對照組和單純肺復(fù)康組沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化(圖2)。

2.3 各組HYP、NO、NO2-/NO3-、MDA水平比較 與正常組相比，模型組 HYP、NO、NO2-/NO3-、MDA 水平均明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，造模+肺復(fù)康組 HYP、NO、NO2-/NO3-、MDA水平均顯著降低(P＜0.05);而單純肺復(fù)康組與對照組相比，上述指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見表1。

圖1 HE染色后各組組織病理學(xué)變化(×400)

圖2 Masson染色后各組組織病理學(xué)變化(×400)

2.4 各組iNOS、CTGF、p-ERK蛋白表達(dá)比較 與對照組相比，模型組iNOS、CTGF、p-ERK表達(dá)水平均明顯增高(P＜0.05);與模型組相比，造模+肺復(fù)康組iNOS、CTGF、p-ERK表達(dá)水平均明顯降低(P＜0.05);對照組與單純肺復(fù)康組相比，iNOS、CTGF、p-ERK表達(dá)水平無顯著差異(P＞0.05)。見圖3，表2。

圖3 各組iNOS、CTGF、p-ERK等的Western印跡電泳圖

表2 各組iNOS、CTGF、p-ERK 的Western印跡結(jié)果(±s，n=10)

表2 各組iNOS、CTGF、p-ERK 的Western印跡結(jié)果(±s，n=10)

組別0.22±0.07 0.23±0.05 0.34±0.09單純肺復(fù)康組 0.26±0.082) 0.25±0.042) 0.37±0.062)造模+肺復(fù)康組 0.31±0.061)2) 0.37±0.031)2) 0.42±0.071)2)模型組 0.43±0.091) 0.49±0.071) 0.56±0.101)iNOS CTGF p-ERK對照組

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，肺纖維化多由脾肺氣虛、肺腎陰虛、痰濁瘀阻所致，所以，中醫(yī)治療以活血化瘀、祛痰除濕為主〔7〕。肺復(fù)康合劑以黃芪為主，配以魚腥草、地龍、丹參等藥物，其中黃芪能夠提高機(jī)體免疫力，減少膠原積聚，具有益氣扶正之功效;魚腥草抑制炎性反應(yīng)，提高機(jī)體免疫功能，具有清熱解毒之功效，地龍、丹參能夠抑制炎癥細(xì)胞分泌、膠原合成、血小板聚集，從而抑制肺成纖維細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗炎、活血化瘀之功效。

肺纖維化作為進(jìn)行性肺組織病變，主要包括細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積、片狀慢性間質(zhì)炎癥、成纖維細(xì)胞增殖、肺泡塌陷等組織病理學(xué)變化。HYP作為機(jī)體膠原蛋白主要成分，約占氨基酸總量13%，而其他彈性蛋白也含有不同含量的HYP，所以，組織中HYP含量可作為膠原組織代謝的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果充分證實肺復(fù)康合劑能夠通過抑制膠原組織代謝、氧化應(yīng)激等方式，抑制BLM誘導(dǎo)的肺纖維化水平，并且分子研究結(jié)果表明肺復(fù)康合劑通過抑制CTGF/ERK通路，發(fā)揮抗纖維化作用。

NO2-/NO3-是NO的代謝產(chǎn)物，肺動脈血漿NO2-/NO3-含量的變化能夠間接反映肺內(nèi)NO變化情況。脂質(zhì)過氧化物MDA含量能夠間接反映肺內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。本研究結(jié)果證實肺復(fù)康合劑能夠有效抑制肺內(nèi)NO異常增多，發(fā)揮肺復(fù)康合劑抑制iNOS活性的作用，有效抑制BLM所致的肺內(nèi)氧化損傷。

BLM作為糖肽類抗生素被廣泛應(yīng)用于癌癥治療中，但是，BLM的毒副作用也較大，能夠破壞肺部結(jié)構(gòu)，引起肺纖維化，因此，BLM也是廣泛應(yīng)用于動物肺纖維化模型的誘導(dǎo)劑〔8〕。氣管灌注BLM后，最初7 d肺部組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)增加、細(xì)胞凋亡增多等急性肺損傷的病理變化，隨后進(jìn)入代償階段，而在28 d左右，細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，形成廣泛肺纖維化〔9〕。本研究依據(jù)上述理論基礎(chǔ)，選擇BLM造模后，各處理組灌胃28 d。結(jié)果表明肺復(fù)康合劑通過抑制膠原合成，發(fā)揮抗纖維化作用。

在肺纖維化過程中，有許多轉(zhuǎn)錄因子被激活，如核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、EGR-1等，這些活化的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控一系列炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的基因表達(dá)，形成瀑布效應(yīng)。所以，轉(zhuǎn)錄因子在肺纖維化發(fā)生機(jī)制的信號級聯(lián)中起著重要的樞紐作用。NF-κB作為目前研究最多的轉(zhuǎn)錄因子，多種因素可以激活NF-κB。NO作為內(nèi)源性自由基，由iNOS合成〔10〕。本研究結(jié)果表明肺復(fù)康合劑通過抑制iNOS蛋白表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮抗纖維化作用。在肺纖維化發(fā)病過程中，NO合成增多，提高NF-κB與DNA結(jié)合力，肺組織磷酸化ERK表達(dá)大幅增高，表明肺纖維化發(fā)病過程中，ERK信號分子可能與NF-κB激活有關(guān)，共同參與肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

CTGF作為轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β的下游調(diào)控因子，被認(rèn)為是肺纖維化進(jìn)展、預(yù)后的標(biāo)志〔11〕。有報道稱，在肺纖維化組織中，CTGF表達(dá)增多〔12〕。本研究中，肺復(fù)康合劑可能通過下調(diào)CTGF蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮抗纖維化功效。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為與纖維化相關(guān)的重要細(xì)胞調(diào)控通路，參與調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖等活動〔13〕。有報道稱，BLM誘導(dǎo)肺纖維化模型中，ERK活性增加〔5〕。有報道稱，EGR-1蛋白至少參與30種以上靶基因調(diào)控，基因啟動子上均有其識別位點GC元件(GCE)，是一類參與炎癥、細(xì)胞生長等病理生物學(xué)過程的重要轉(zhuǎn)錄因子，對TGF-β、TF等基因具有強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)錄活化作用。本研究結(jié)果表明BLM通過激活ERK，誘導(dǎo)EGR-1激活，繼而引起肺纖維化過程，而肺復(fù)康合劑通過抑制ERK磷酸化水平，阻斷ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮抗纖維化功效。

綜上所述，肺復(fù)康合劑通過抑制促纖維化因子iNOS表達(dá)及ERK信號通路，減少BLM所致的應(yīng)激損傷、病理變化、膠原合成，發(fā)揮抑制肺纖維化的藥理作用。

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The inhibition role and related mechanism of Feifukang mistura on rat pulmonic fibrosis

ZHAO Min，LI Jiong，SONG Xiao-Dong，et al.
Binzhou Medical University Medicine＆ Pharmacy Research Center，Yantai 264003，Shandong，China

40 male SD rats were randomized into control，model，model+Feifukang，Single Feifukang groups.The rats in model and model+Feifukang groups were given intratracheal injection of bleomycin(1 mg/kg)，and the rats in control and single Feifukang groups were given intratracheal injection of normal saline alone as the equivalent dose.The rats were treated Feifukang mistura(12 ml/kg intragastrically)for 28 d in model+Feifukang and single Feifukang groups.The lung coefficient，lung dry weight/body weight，hydroxyproline(HYP)，nitric oxide(NO)of lung tissues，and NO2-/NO3-，malondialdehyde(MDA)of pulmonary artery plasma in all groups were measured.The expressions of nitric oxide synthase(iNOS)，connective tissue growth factor(CTGF)and phosphorylation extracellular regulated protein kinase(p-ERK)were detected by Western blot in all groups.ResultsCompared with that of control group，the lung coefficient，lung dry weight/body weight，the levels of HYP，NO，NO2-/NO3-，MDA were obviously increased，and the expression levels of iNOS，CTGF and p-ERK were significantly increased in model group(P＜0.05);Compared with those of model group，the lung coefficient，lung dry weight/body weight，the levels of HYP，NO，NO2-/NO3-，MDA were obviously decreased，and the expression levels of iNOS，CTGF and p-ERK were significantly decreased in model+Feifukang group，the indexes of pulmonary fibrosis were significantly improved(P＜0.05).The above parameters between the single Feifukang and the control groups were obviously changed(P＞0.05).ConclusionsFeifukang mistura inhibits the bleomycin-induced oxidative stress，histological alterations and collagen depositions and plays the pharmacological effects of anti-pulmonary fibrosis via the inhibition of the pro-fibrotic cytokine iNOS，CTGF expressions and the ERK pathway.

Feifukang mistura;Pulmonic fibrosis;iNOS;CTGF;ERK

R56

A

1005-9202(2015)09-2342-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.015< class="emphasis_bold">【Abstract】 Objective

Objective To study the inhibition role and related mechanism of Feifukang mistura on rat pulmonic fibrosis.Methods

國家自然科學(xué)基金(81273957);山東省自然科學(xué)基金(ZR2013HM051);濱州醫(yī)學(xué)院科技重點計劃(BY2012KJZD10)

呂長俊(1963-)，男，教授，博士，主要從事間質(zhì)性肺疾病的診斷及治療研究。

趙 敏(1979-)，女，碩士，主要從事呼吸疾病研究。

〔2014-09-16修回〕

(編輯 袁左鳴)