賈成友，于金英，張傳輝，王云紅，禹奇男，楊榮平

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都 611137；2.重慶市中藥研究院中藥制劑研究所，重慶 400065）

國內外青蒿素生產過程差異性比較

賈成友1,2，于金英1,2，張傳輝1,2，王云紅2，禹奇男1,2，楊榮平1,2

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都 611137；2.重慶市中藥研究院中藥制劑研究所，重慶 400065）

青蒿（Artemisia apiacea）系菊科（Compositae）植物黃花蒿（Artemisia annua L.）的干燥地上部分，具有清熱解暑、除蒸截瘧之功效，主治暑熱、暑濕、濕溫、陰虛發(fā)熱、瘧疾和黃疸等癥[1]?，F代藥理研究表明，青蒿在抗瘧、抗腫瘤、抗菌殺蟲、抑制免疫功能亢進、抗心律失常、抗孕、抗單純皰疹病毒等方面作用明顯，同時可用于紅斑狼瘡、心律失常的治療以及降低機體本身對類風濕性關節(jié)炎的過度免疫[2-4]。

青蒿素是從青蒿中提取分離出的含過氧橋基的新型倍半萜內酯，分子式C15H22O5，分子量282.34，具有抗瘧、抗菌、解熱、增強免疫等藥理活性，尤為適宜于惡性瘧疾、腦型瘧疾的治療，是世界衛(wèi)生組織推薦治療瘧疾的首選藥物[5,6]。我國學者許杏祥等在1986年經化學反應首次合成了青蒿素，詮釋了全合成途徑和關鍵反應參數[7]，此后，國外也相繼開展了有關青蒿素全合成途徑和方法的研究。合成所常用的原料主要有香茅醛、異胡薄荷醇、異檸檬烯、薄荷酮、β-蒎烯和環(huán)己烯酮等[8]。青蒿素的化學全合成研究雖取得了一定進展，但由于合成路線繁瑣、難度大，工藝復雜、成本高，不適合工業(yè)化生產[9]等種種因素，青蒿素化學合成在工業(yè)生產中難以普遍開展，其商業(yè)價值也未得以體現。因此，國內外研究者開始轉向青蒿素合成生物學及代謝工程研究，以期在微生物體內構建青蒿素生物合成途徑，并對青蒿中原有的青蒿素生物合成途徑進行遺傳改良，從而增加青蒿素產量[10]。本研究通過比較國內外青蒿素生產過程的差異，分析國內在青蒿素生產研究方面存在的問題，并提出了解決此類問題的方法和建議，為青蒿素進一步研究提供參考依據。

1 青蒿素獲取途徑

青蒿素主要來源于以下3個方面：直接從青蒿藥材中提取、單體物質經過多步化學反應合成或通過組織培養(yǎng)和轉基因克隆法生物合成。在我國，青蒿素主要依靠從青蒿中直接提取，而國外則多通過化學合成和生物合成得到青蒿素或增加其產量。

2 青蒿素研究領域

國內，醫(yī)藥研究者充分發(fā)揚中國在青蒿素科學研究上的傳統(tǒng)優(yōu)勢，研究領域多集中在快速高效提取、分離純化和檢測青蒿素及青蒿素轉基因青蒿植株培育、青蒿素合成生物學和代謝工程方面；國外，青蒿素研究領域不僅囊括青蒿素轉基因青蒿植株培育、青蒿素合成生物學和代謝工程，而且開始轉向以異源生物作為反應器來高效生產青蒿素，并已經成功生物合成了青蒿素。此外，國內外醫(yī)藥工作者在青蒿素研究的基礎上合成開發(fā)出的青蒿琥酯（artesunate）、蒿甲醚（artemether）、蒿乙醚（arteether）和二氫青蒿素（dihydroartemisinin）等，血中溶解度好，生物利用度高，對抗氯喹性瘧疾及致命性腦型瘧有很好的治療效果[11]，有效地避免或延緩了惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物抗藥性情況的發(fā)生。

3 國內外青蒿素生產過程差異性比較

3.1 國內青蒿素生產過程

3.1.1 直接從青蒿中提取青蒿素

青蒿廣泛分布于我國南北各地，但是野生生長和集中種植地域狹窄，不同產地青蒿中青蒿素含量差異較大（0.12%～1.30%）[12]，以重慶酉陽所產青蒿素含量居多。

3.1.1.1 提取方法

目前，我國青蒿素主要由青蒿飲片經處理后提取、純化而來。常用的青蒿素提取方法有傳統(tǒng)溶劑法及近些年發(fā)展起來的新型提取工藝和聯用技術[13]。傳統(tǒng)溶劑法包括室溫提取、冷浸提取、索氏提取、回流提??；新型提取工藝技術包括超聲提取技術、超臨界CO2萃取技術、微波輔助萃取技術和快速溶劑萃取技術等。

近年來，我國醫(yī)藥工作者在傳統(tǒng)溶劑提取法的基礎上，結合青蒿藥材和青蒿素物化特點，采用新型提取工藝和聯用技術對青蒿素高效提取開展了一系列研究。張穎[14]以青蒿素提取量為考察指標，采用有機溶劑提取法，在單因素試驗基礎上，進行3因素3水平正交試驗，得出青蒿素最佳提取工藝條件，在該條件下青蒿素提取量達5.27 mg?g-1。盧婉怡[15]利用響應面試驗設計法考察纖維素酶輔助提取過程中時間、加酶量、溫度對青蒿素提取率的影響，并對提取工藝條件進行優(yōu)化，結果優(yōu)化條件下青蒿素提取率較未使用酶輔助提取工藝提高了1.89倍。另有研究者通過超臨界CO2萃取法對青蒿中青蒿素進行提取，同時考察萃取壓力、溫度以及時間對青蒿素收率的影響，優(yōu)化了提取工藝，使得青蒿素提取效率大大提高[16]。研究還發(fā)現，采用微波輔助提取法、快速溶劑萃取法提取青蒿素，與傳統(tǒng)溶劑提取結果相比較后發(fā)現，二者提取效率顯著高于傳統(tǒng)溶劑提取法[17-20]。此外，徐朝輝等[13]將超聲提取-膜過濾-超臨界萃取聯用技術用于青蒿素的提取，大大提高了青蒿素的收率（0.48%）和純度（92%），減少操作工序及污染，提高效益。鄧啟華等[21]將連續(xù)逆流技術與超聲波技術結合，應用到黃花蒿中青蒿素的提取試驗中，不僅加快了提取速率，同時使青蒿素的提取率高達89%。各提取方法原理和特點如表1所示。

3.1.1.2 純化手段

目前，文獻報道有關青蒿素分離純化工藝的研究方法主要有大孔樹脂吸附法和硅膠柱層析法等。龐斐等[26]采用超臨界流體色譜技術對青蒿萃取液中青蒿素進行提純，使得青蒿素的含量達到74.83%。韋國鋒等[27]采用ADS-17大孔吸附樹脂提取青蒿素，使得青蒿素提取率高達75%，青蒿素含量大于99%。胡淼等[28]利用硅膠柱層析純化超臨界CO2提取所得青蒿素膏體，使得青蒿素含量可由原來的15%提高到70%以上，回收率達90%。周凌云[29]采用硅膠柱層析法純化青蒿素，利用不同比例石油醚與乙酸乙酯進行梯度洗脫，90%乙醇結晶，考察填料、洗脫劑及層析次數對純化的影響，結果青蒿素含量高達 97.5%。由此可見，青蒿素可以通過大孔吸附樹脂和硅膠柱層析達到分離純化的目的。而南加州大學Chandrakant R等人[30]采用槲皮素反溶劑結晶法純化青蒿素，同樣取得良好成效，提示后期青蒿素純化研究不宜僅僅局限于一個方面，應關注國際研究形式，多方位多靶點研究青蒿素純化方法，可以開發(fā)一種專門針對青蒿素富集純化的青蒿素接枝交聯殼聚糖樹脂，用于青蒿素的純化。

綜上，青蒿素的獲取已形成一個從提取到分離純化的完整流程。事實上，青蒿素提取、分離純化中仍存在有效成分提取不完全、溶劑殘留等問題，亟待進一步地研究與改善。根據表1中內容，對比各提取方法可知，尋求一種簡單方便，提取率高，溶劑殘留少，成本低，適合工業(yè)化生產的提取方法、純化工藝顯得尤為重要。

3.1.2 轉基因植株培育

在生物合成青蒿素研究領域，我國主要側重于青蒿植株的組織培養(yǎng)和轉基因植物研究，并取得了顯著成效。葉和春等首次將重組法呢基焦磷酸合成酶基因（FPS）導入青蒿，增加了FPS基因的拷貝數目，由此獲得青蒿素含量比對照高約4倍的轉基因青蒿發(fā)根（0.2%～0.3%）[31]及比對照高約3倍的轉基因青蒿植株（0.8%～1.0%）[32,33]。曾慶平[34]等將反義鯊烯合酶基因（asSS）導入青蒿，阻斷了競爭青蒿素生物合成的類固醇分支途徑，獲得的青蒿植株類固醇含量比對照植株降低近一半，同時，植株青蒿素含量比對照植株提高近3倍。Chen JL等[35]利用β-石竹烯合酶cDNA反義片段抑制青蒿的倍半萜合成支路，減少了β-石竹烯對紫穗槐-4,11- 二烯的競爭抑制，使得青蒿素含量提高50%。另有研究發(fā)現，青蒿素主要在青蒿葉片腺狀分泌毛狀體中合成[36]，細胞分裂素可刺激葉片生長，故推斷提高青蒿中的細胞分裂素水平有可能促進青蒿素的合成。Geng S 等[37]將異戊烯基轉移酶基因（ipt）導入青蒿，使細胞分裂素水平提高近3倍，青蒿素含量增加了30%-70%。諸如此類的研究成果直接或間接應用于青蒿素的實際生產，使得青蒿素類藥物產量大增，為降低瘧疾發(fā)病率和死亡率，解決青蒿素原料藥供不應求，市場價格飆升[10]的問題帶來了新契機。

3.2 國外青蒿素生產過程

合成生物學作為一項新興領域，潛在地改善著全球健康，依靠其合成的新藥物，可再生化學品或清潔能源正慢慢走進人們的生活[38,39]。國外，醫(yī)藥研究者在微生物中合成青蒿素前體后選擇改用化學方法半合成青蒿素，并已啟動產業(yè)化進程。已有研究證實，青蒿素生物合成途徑屬于植物類異戊二烯代謝途徑。該途徑有酶和能產生青蒿素前體物質的異源生物的參與，同時受到基因調控的影響。

參與類異戊二烯代謝途徑的關鍵酶主要有3-羥基-3- 甲基戊二酰CoA還原酶（HMGR）[40,41]，法呢基焦磷酸合酶（FPPS）[40]，紫穗槐-4,11- 二烯合酶（ADS）[42]，紫穗槐-4,11- 二烯P450單加氧酶[43]等。中間體主要有青蒿酸[7]，青蒿素B[44]，青蒿烯[45]，二氫青蒿素[46]四種。鑒于關鍵酶和中間體研究開始的比較早，研究成果較成熟，文獻、綜述中多有論述，本文不做詳細介紹，僅從利用異源生物為載體通過基因調控體內合成青蒿素方面加以闡釋。

常用的異源生物包括大腸桿菌、沙門氏桿菌、酵母和煙草等。大腸桿菌生長快速，遺傳性好，與沙門氏桿菌在形態(tài)上和生理上都極其相似，并可以執(zhí)行一個基于內生大腸桿菌transcription-translation（TX-TL）游離表達系統(tǒng)產生等效大量蛋白質T7的高效系統(tǒng)[47]。酵母菌與植物親緣關系比較接近，發(fā)酵時間短，產物量高，且可以簡化提取和純化過程。煙草葉片生物信息量大，具有精細的調控系統(tǒng)，可以通過光合作用獲得代謝前體物質，且遺傳轉化研究較多，種種特點使得大腸桿菌、沙門氏桿菌、酵母、煙草等被用作分子代謝物異源表達的宿主，用以青蒿素的合成。

早在2001年，Wallaart[40]等已將ADS基因導入煙草，并成功獲得了可以產生0.2～1.7 ng?g-1鮮重的紫穗槐-4,11- 二烯轉基因煙草，發(fā)現 ADS基因在轉基因植物中能表達出有活性的蛋白，為之后通過青蒿轉基因植株提高青蒿素產量的研究奠定基礎。Newman等[48]通過對酵母菌發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，利用紫穗槐-4,11- 二烯工程菌，采用兩相發(fā)酵法，使紫穗槐-4,11- 二烯的產量達到0.48 g?L-1。Kajiwara等[49]將IPP異構酶編碼基因（idi）在細菌中過量表達，結果提高了類異戊二烯的積累量。另有文獻[50]報道稱，通過對半域突變等位基因upc2-1 過量地表達，可以在一定程度上提高了紫穗槐-4,11- 二烯的產量，使紫穗槐-4,11- 二烯的產量達到153 mg?L-1，與Martin等[51]利用工程大腸桿菌生產紫穗槐-4,11-二烯的產量相比較提高近500倍。Starai等[52]通過調控沙門氏桿菌乙酰輔酶A合酶，發(fā)現乙酰基轉移酶對乙酰輔酶A合成酶609位點的賴氨酸乙?；?，使乙酰輔酶A 合成酶失活，而輔酶II（NADP）依賴性Sir2蛋白催化乙酰輔酶A合成酶脫去乙?；?，從而使其恢復酶活性。Shiba課題組[53]以此為基礎，將質粒載體將沙門氏桿菌乙酰輔酶A合成酶去乙?；稽c基因L641P與ALD6基因轉入紫穗槐-4,11- 二烯工程酵母中，結果紫穗槐-4,11-二烯的量提高了1.9 倍。Redding-Johanson 和Westfall 兩個課題組[54,55]先后通過對代謝途徑中的酶進行啟動子修飾，進而提高了工程菌中紫穗槐-4,11- 二烯的產量，為進一步的合成提供了有力支持。不同的是，前者僅對甲羥戊酸激酶和磷酸甲羥戊酸激酶進行修飾表達，而后者對整條代謝途徑過程中的酶基因都進行了啟動子修飾。對比二者結果發(fā)現，對全部參與的酶都表達可以使青蒿酸、紫穗槐-4,11- 二烯產量大為增加，可見酶在生物合成中起到舉足輕重的作用?？刂啤⒄{控好酶的作用就為中間產物和青蒿素的生成奠定了基礎。目前，科研領域已經有報道[56]，將酵母菌和煙草作為紫穗槐-4,11- 二烯、青蒿酸中間體人工制備系統(tǒng)的宿主細胞，可制備出青蒿素，雖然產量較低，但是意義重大，表明通過異源宿主細胞可以獲得青蒿素。今后研究中，以此類中間體為合成前體，再通過廣泛的半合成青蒿素的研究，青蒿素的產量將會無限接近工業(yè)化的水平，青蒿素類藥物供需不平衡的偏態(tài)將被打破，為有效地降低青蒿素的價格，控制瘧疾在貧困國家的肆虐起到應有的作用。

4 問題與展望

至今青蒿素類藥物仍然是治療惡性瘧疾、腦型瘧疾的首選藥。鑒于青蒿素類藥物需求量逐漸增加的態(tài)勢，實現青蒿素高效、多產就顯得尤為重要。國內外青蒿素生產過程存在差異，我國主要從青蒿中直接提取獲得青蒿素，并結合轉基因誘導提高青蒿中青蒿素含量；而國外則通過在微生物中合成青蒿素的前體后改用化學方法半合成青蒿素，或以大腸桿菌、酵母菌和煙草為宿主細胞，體內合成青蒿素。造成這種研究側重點存在差異的原因有歷史和現實雙重因素。青蒿在中國有著悠久的種植和使用歷史，人們更愿意以傳統(tǒng)的思維和手段去研究、利用它，開發(fā)也只局限于青蒿轉基因植物的培育方面，在生物合成方面雖有涉及但研究不夠深入。國外研究者不受傳統(tǒng)經驗和研究方法的束縛，更傾向于向更深領域的開拓，這也促成了他們在生物合成青蒿素領域處于遙遙領先的地位。

青蒿素的研究開發(fā)是一段艱辛的路程，我們可以借鑒國外研究的最新成果，加快國內青蒿種植和青蒿素產業(yè)化建設，同時也應該形成自己的特色：研究過程中應著力加強青蒿素轉基因青蒿植株的田間試驗和評價，加強青蒿素合成反應的分子物質基礎研究，以此建立青蒿及轉基因青蒿中由中間體轉變?yōu)榍噍锼氐耐獠織l件，從而實現優(yōu)質、高產等優(yōu)轉基因青蒿品種的普及和應用；此外，還應重點完善青蒿素高效提取方法，解決溶劑殘留問題，優(yōu)化青蒿素純化工藝，建立青蒿素快速高效檢測方法，為青蒿素工業(yè)化生產提供依據，造福數億患者。

摘編自《世界科學技術—中醫(yī)藥現代化》2015年3期：734～739頁，圖、表、參考文獻已省略。