孔建強，王偉，程克棣，朱平

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點實驗室，北京 100050）

青蒿素的合成生物學(xué)研究進展

孔建強，王偉，程克棣，朱平

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，衛(wèi)生部天然藥物生物合成重點實驗室，北京 100050）

青蒿素是一種非常優(yōu)良的抗瘧藥物，存在活性好、毒副作用小、市場需求大、來源窄等特點，從而導(dǎo)致價格昂貴，不利于疾病的治療和預(yù)防，嚴重影響人類的健康安全。因此，需要建立一種大規(guī)模的、廉價生產(chǎn)這種藥物的替代方法。現(xiàn)在看來，天然藥物合成生物技術(shù)無疑是最理想的。天然藥物合成生物學(xué)是在以基因組解析技術(shù)和化學(xué)合成技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)基礎(chǔ)上，將工程學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)相結(jié)合，綜合分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、藥物化學(xué)、藥物合成、藥物分析、藥理學(xué)等學(xué)科，建立起來的以規(guī)?；统绦蚧苽涮烊凰幬餅槟康牡募蓪W(xué)科。從本質(zhì)上說，天然藥物合成生物學(xué)技術(shù)是一種采用綠色、可持續(xù)發(fā)展方式規(guī)?；苽涮烊凰幬锏墓こ袒锖铣杉夹g(shù)，代表著未來天然藥物制備的發(fā)展方向之一。其研究內(nèi)容目前主要包括兩個方面：一是天然藥物固有代謝途徑的解析、重構(gòu)與工程化，即通過基因工程，將天然藥物生物合成相關(guān)途徑酶基因?qū)氪竽c桿菌、釀酒酵母以及模式植物細胞中，在這些底盤細胞中重構(gòu)一條天然藥物的生物合成途徑，將這些細胞構(gòu)建成能制備天然藥物的“細胞工廠”，利用“細胞工廠”生長繁殖快的特點，源源不斷的制備天然藥物；二是全新天然藥物合成途徑的設(shè)計、篩選、組裝與程序化，即根據(jù)天然藥物的生源合成途徑，從基因數(shù)據(jù)庫中尋找相應(yīng)的酶基因，并將這些酶基因轉(zhuǎn)移到底盤細胞中，組裝成一條全新的多基因控制的藥物合成途徑，利用這條代謝途徑制備出結(jié)構(gòu)優(yōu)化、產(chǎn)量豐富的天然藥物。經(jīng)過十幾年的發(fā)展，天然藥物合成生物技術(shù)已被成功地應(yīng)用到青蒿素的規(guī)?；苽渲校⑷〉昧艘幌盗谐晒?。

1 青蒿素生物合成及相關(guān)酶基因研究進展

青蒿素生物合成途徑現(xiàn)在并不是完全清楚。根據(jù)相關(guān)中間體的分離和結(jié)構(gòu)鑒定[1-8]，以及生物合成相關(guān)酶基因的克隆與功能鑒定[9-27]，再加上原位青蒿素飼喂實驗[3,7,8,28,29]綜合分析，推斷青蒿素的生物合成主要包括四大步驟：第一步是通過甲羥戊酸途徑和非甲羥戊酸兩條途徑形成法尼基焦磷酸（farnesylpyrophosphate，F(xiàn)PP）[30,31]；第二步是在紫穗槐-4,11-二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）的作用下將 FPP環(huán)化形成青蒿素的中間體紫穗槐-4,11-二烯[19-21]；第三步是在紫穗槐-4,11-二烯氧化酶（amorpha-4,11-diene oxidase，AMO）的作用下，紫穗槐-4,11-二烯進一步被氧化形成青蒿醇、青蒿醛，進而合成青蒿酸和/或二氫青蒿酸[22,23,25]；第四步是青蒿酸和/或二氫青蒿酸通過一系列酶反應(yīng)和/或非酶反應(yīng)形成青蒿素（圖 1）[28,29,32,33]。在這條合成途徑中，第四步爭議最大。早期的研究表明，青蒿酸是青蒿素最直接的前體[32,33]；而隨著青蒿素分子生物學(xué)的發(fā)展，二氫青蒿酸是青蒿素最直接的前體又逐漸被研究人員提出[3,7,8,29]。究竟誰是青蒿素最直接前體，現(xiàn)在尚無定論。推測青蒿中可能存在至少兩條青蒿素生物合成途徑，即分別以青蒿酸和二氫青蒿酸為最直接前體的兩條生物合成途徑，不同青蒿中存在哪條合成途徑取決于其化學(xué)型[34,35]。

參與青蒿素生物合成途徑的酶基因中，參與FPP生物合成的酶基因絕大部分都已經(jīng)通過克隆得到，如脫氧木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXPS）[9,10]、脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxyxylulouse 5-phosphate reductoisomerase，DXPR）[9,11,12]、1-羥基-2-甲基-2-丁烯基-二磷酸合酶（1-hydroxy-2-methyl-2-butenyl diphosphatesynthase，HDS）[13]、1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸還原酶（hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl 4-diphosphate reductase，HDR）[14]、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzymeA reductase，HMGR）[15]和法尼基焦磷酸合酶基因（farnesyl pyrophosphate synthase，F(xiàn)PPS）[16-18]等。而以FPP為底物特異合成青蒿素的酶基因也有部分被克隆并進行了功能鑒定。如紫穗槐-4,11-二烯合酶[19-21]、紫穗槐-4,11-二烯氧化酶[22-24]、細胞色素P450氧化還原酶（cytochrome P450 oxidoreductase，CPR）[22]、青蒿醛雙鍵還原酶[25]和醛脫氫酶[26]等編碼基因的克隆與功能鑒定。在上述酶基因中，參與萜類共同前體FPP生物合成的酶基因保守性較強，性質(zhì)穩(wěn)定，較多的見于各種實驗論文和綜述中，本文不作詳細介紹。紫穗槐-4,11-二烯合酶是青蒿素生物合成的第一個特異性酶，其性質(zhì)與基因克隆、功能鑒定參考筆者以前的綜述[27]。下面對其余參與青蒿素合成的特異性酶基因作簡單介紹。

1.1 紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因

在青蒿或非青蒿植物中，存在著多個能氧化紫穗槐-4,11-二烯的酶[22-24,36]。2005年，Bertea等[3]以青蒿葉片微粒體酶對紫穗槐-4,11-二烯進行催化實驗，結(jié)果在產(chǎn)物中檢測到了青蒿醇的存在。根據(jù)這個結(jié)果，以及青蒿醇和紫穗槐-4,11-二烯相似的結(jié)構(gòu)特點，Bertea等推斷在青蒿中存在一個P450羥基化酶，這個酶能將紫穗槐-4,11-二烯催化生成青蒿醇。

2006年，美國的 Keasling[22]和加拿大的 Covello[23]兩個實驗室先后從青蒿腺毛中克隆得到了紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因CYP71AV1，并進行了功能鑒定，但對于CYP71AV1編碼框的大小，這兩個實驗室的結(jié)果有所不同。Keasling實驗室推斷CYP71AV1長為1485 bp，編碼494氨基酸的蛋白，而Covello實驗室推斷CYP71AV1長為1464 bp，編碼487氨基酸的蛋白，通過對兩個實驗室提供的具體序列進行分析，發(fā)現(xiàn)Keasling實驗室多出的堿基位于CYP71AV1的5' 末端。盡管在氨基酸序列上存在差異，但這兩個實驗室對這兩個蛋白都進行了功能鑒定，發(fā)現(xiàn)這兩個蛋白都能將紫穗槐-4,11-二烯連續(xù)催化形成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸，是多功能酶。隨后幾年，CYP71AV1基因被不同實驗室的科研人員從不同的青蒿株系中克隆得到[37,38]，目前，在GenBank中注冊的CYP71AV1基因已有十幾條。CYP71AV1的編碼序列和現(xiàn)在已知的其他P450之間的一致性很低，最高51%，表明該P450是一種菊科植物特異的P450氧化酶，考慮到青蒿素是青蒿中的特異成分，有理由推測CYP71AV1參與了青蒿素的生物合成途徑。進一步的功能鑒定證實了這個結(jié)論。CYP71AV1對底物具有特異性，只能作用于紫穗槐-4,11-二烯，而對其他單萜和倍半萜如檸檬烯（limonene）、α-蒎烯（α-pinene）、β-蒎烯（β-pinene）、松香芹醇（pinocarveol）、（-）-異長葉烯（-）-alloisolongifolene）、石竹烯（caryophyllene）、（-）-α-古蕓烯（-）-α-gurjunene）、（+）- γ-古蕓烯（+）-γ-gurjunene）、（+）-喇叭烯（+）-ledene）、（+）-β-芹子烯（+）-β-selinene）和（+）-朱欒倍半萜（+）-valencene）則沒有活性。CYP71AV1的表達具有組織特異性，RT-PCR結(jié)果表明，CYP71AV1在腺毛中的表達水平最高，其次是花芽（flower bud），而在葉和根中的表達水平非常低，幾乎檢測不到RT-PCR產(chǎn)物[23]。

Teoh等[23]通過進一步的試驗表明，CYP71AV1除了能作用于紫穗槐-4,11-二烯，連續(xù)形成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸之外，還能作用于二氫青蒿醇，形成二氫青蒿醛，但對二氫青蒿醛幾乎沒有活性。

除了從青蒿中克隆青蒿素生物合成相關(guān)基因之外，2010年，Nguyen等[24]從包括菊芋（Cichoriumintybus L.）在內(nèi)的5種菊科植物中分離得到了5個大香葉烯A氧化酶（germacrene A oxidase）cDNA，功能鑒定表明，大香葉烯A氧化酶除了能連續(xù)氧化大香葉烯A形成對應(yīng)的酸外，還能連續(xù)氧化紫穗槐-4,11-二烯形成青蒿酸，但當(dāng)這些氧化酶和來自青蒿的電子配偶體CPR偶聯(lián)進行氧化反應(yīng)時，其對紫穗槐-4,11-二烯的氧化活性要低于 CYP71AV1。這是第一例從非青蒿植物中分離得到具有氧化紫穗槐-4,11-二烯活性的氧化酶的報道。

2011年，Cankar等[36]從菊芋根中除了克隆得到上面介紹的大香葉烯A氧化酶cDNA外，還克隆得到一個P450氧化酶CYP71AV8基因，該基因CDS長為1491 bp，編碼496氨基酸，和CYP71AV1（DQ315671）的氨基酸一致性為78%，與大香葉烯A氧化酶（GU256644）的氨基酸一致性為81%。該酶除了催化（+）-valencene 生成（+）-nootkatone之外，還能分別催化大香葉烯A和紫穗槐-4,11-二烯生成germacra-1（10），4,11（13）-trien-12-oic acid和青蒿酸，與CYP71AV1不同的是，將紫穗槐-4,11-二烯投入該酶的反應(yīng)體系中時，在反應(yīng)產(chǎn)物中除了檢測到了青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸之外，還檢測到了二氫青蒿醛。多個具有紫穗槐-4,11-二烯氧化功能的P450酶的出現(xiàn)豐富了合成生物學(xué)制備青蒿素前體的可能性，同時，通過對這些酶進行進化分析，可能衍生得到具有超強紫穗槐-4,11-二烯氧化功能的P450酶。

1.2 細胞色素P450還原酶基因

CYP71AV1是一種 P450氧化酶，其不能單獨發(fā)揮作用，必須由電子配偶體的配合。2006年，Keasling實驗室在克隆得到CYP71AV1后，從青蒿中將CYP71AV1的電子配偶體——細胞色素P450還原酶基因也克隆了出來[22]。

1.3 青蒿醛雙鍵還原酶

2008年，Zhang等[25]通過綜合運用蛋白部分純化、質(zhì)譜和EST文庫的方法從青蒿中克隆得到一個青蒿醛Δ11（13）雙鍵還原酶基因，命名為Dbr2。Dbr2基因長為1245 bp，編碼414氨基酸的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為45.6 kD。Dbr2蛋白和植物的12-氧代植二烯酸還原酶（12-oxophytodienoate reductases）蛋白家族具有最高的氨基酸一致性。Dbr2 的180、183和185位含有3個高度保守的組氨酸。Dbr2的最適pH是7.5，當(dāng)pH為5.5時，Dbr2的活性被抑制，當(dāng)pH為9.0 時，Dbr2的活性只有20%。Dbr2在腺毛中表達最高，特異性地作用于青蒿醛，生成11R-二氫青蒿醛，對青蒿酸、青蒿醇、artemisitene 和arteannuin B均無活性。

2009年，Zhang等[39]從青蒿中分離得到一個雙鍵還原酶，命名為Dbr1，這個蛋白長為346氨基酸，分子質(zhì)量為38.5 kD，基因編碼長度為1041 bp。Dbr1含有一個富含甘氨酸的的多肽序列——AASGAVG，這個結(jié)構(gòu)參與了結(jié)合NAD（P）H 和NAD（P）中的焦磷酸基團。底物結(jié)合位點處含有1個保守性很高的Tyr，在Dbr1中含有1個保守的催化結(jié)構(gòu)域SQY。在Dbr1的C末端有1個保守結(jié)構(gòu)域GKNVGKQVVXVAXE，但其功能尚不清楚，Dbr1最適pH是7.0，用NADH做輔助因子時，沒有活性。Dbr1和Dbr2一樣，也能催化青蒿醛形成二氫青蒿醛，但產(chǎn)物以11S-二氫青蒿醛為主，此外，在待檢測的底物中，Dbr1和Dbr2共同的底物只有青蒿醛和2E-nonenal。

1.4 醛脫氫酶

2009年，Teoh等[26]從青蒿中分離得到1個醛脫氫酶基因，命名為Aldh1。該基因CDS長為1497 bp，編碼498氨基酸，分子質(zhì)量是53.8 kD。ALDH1的N末端無信號肽，也沒有細胞器定位序列。ALDH1含有兩個非常保守的結(jié)構(gòu)域，一個是含有谷氨酸活性位點的保守結(jié)構(gòu)域，另一個是含有半胱氨酸活性位點的保守結(jié)構(gòu)域。這兩個保守結(jié)構(gòu)域參與了ALDH1的催化功能。此外，ALDH1還含有保守的4個氨基酸，分別是Gly243、Gly297、Glu397 和Phe399，這4個氨基酸參與了與輔因子的結(jié)合。ALDH1在腺毛中表達最高，在花芽中表達適中，在葉子中表達較低，而在根中檢測不到活性，這種表達方式與CYP71AV1的很相似，也與青蒿素在植物中的分布很相似，表明ALDH1可能參與了青蒿素的生物合成。ALDH1 能作用于青蒿醛和二氫青蒿醛，生成相應(yīng)的青蒿酸和二氫青蒿酸。此外，該酶對短鏈的烷基醛（alkyl aldehye）也有弱的活性。以二氫青蒿醛為底物時，其最適pH是8.5，用NAD和NADP作輔因子時都有活性。

2 青蒿素合成生物學(xué)研究特點

青蒿素的合成生物學(xué)研究是伴隨其生物合成途徑的逐步闡明而發(fā)展起來的。由于從青蒿酸/二氫青蒿酸形成青蒿素的途徑不是很清楚，現(xiàn)在通過合成生物學(xué)技術(shù)制備青蒿素的研究絕大部分采用的都是一種半合成的路線。即通過代謝工程制備青蒿素的前體如紫穗槐-4,11-二烯[40，41]、青蒿酸[42，43]和二氫青蒿酸[25]，然后通過半合成的方法合成青蒿素[40-43]。經(jīng)過若干年的發(fā)展，青蒿素合成生物學(xué)的研究取得了重要進展，呈現(xiàn)如下幾個特點。

2.1 底盤細胞種類多樣

與普通異源宿主不同的是，用于合成生物學(xué)研究的底盤細胞是一種遺傳背景清楚、按照工程化原理構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化集成細胞，可以為模塊工作提供穩(wěn)定場所，并能用于工業(yè)化生產(chǎn)。迄今為止，用于青蒿素及其中間體合成生物學(xué)研究的底盤細胞有大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、植物細胞和其他微生物（表1）。

E.coli是所有工程菌中開發(fā)最早、最成熟的一種。盡管缺少糖基化和翻譯后加工等功能，但大腸桿菌具有遺傳背景清楚、生長快速、生長周期短、安全性好、可以進行高密度培養(yǎng)、適合表達不同基因產(chǎn)物和成本低及易于操作等優(yōu)點，因此成為青蒿素合成生物學(xué)研究中首選的宿主菌，已經(jīng)在大腸桿菌中重構(gòu)了紫穗槐-4,11-二烯[40,44-55]和青蒿酸[52]等青蒿素中間體的合成途徑。

釀酒酵母是一種真核生物，因其具有內(nèi)膜系統(tǒng)，更適合包括P450氧化酶等基因在內(nèi)的植物次生代謝酶基因的表達，因此，在青蒿素合成生物學(xué)研究中，被更多的作為紫穗槐-4,11-二烯[22,41,55-63]、青蒿酸[22,25,36,37,41-43,64-65]和二氫青蒿酸[25]等重要中間體人工制備系統(tǒng)的宿主細胞。

和微生物相比，植物表達系統(tǒng)有自己的優(yōu)勢，如具有精細的調(diào)控系統(tǒng)，能通過光合作用獲得代謝前體物質(zhì)等。利用植物表達系統(tǒng)制備的萜類化合物產(chǎn)量一直很低，提高幅度較慢，但植物表達系統(tǒng)是獲得代謝產(chǎn)物種類最多的底盤細胞。已經(jīng)獲得了紫穗槐-4,11-二烯[21,66-70]、青蒿醇[68]、二氫青蒿醇[68]、青蒿酸糖苷[69]和青蒿素[70]等代謝產(chǎn)物。

除了上述幾種比較常見的底盤細胞外，構(gòu)巢曲霉也被用來制備紫穗槐-4,11-二烯[71]。

2.2 青蒿素合成生物學(xué)研究實現(xiàn)了多種產(chǎn)物的制備

在青蒿素的合成生物學(xué)研究中，已經(jīng)可以通過煙草制備出抗瘧藥物青蒿素[70]，盡管產(chǎn)量較低，但這個開創(chuàng)性的報道具有非常重要的意義。首先表明通過異源宿主細胞可以獲得青蒿素，其次，加深對青蒿素生物合成途徑的了解，從而促進青蒿素合成生物學(xué)的進一步發(fā)展。除此之外，通過合成生物學(xué)研究還制備獲得了不同的青蒿素中間體，如紫穗槐-4,11-二烯[21,22,40,41,44-63,66-70]、青蒿醇[68]、二氫青蒿醇[68]、青蒿酸[22,36,37,41,52,64-65]、青蒿酸糖苷[69]和二氫青蒿酸[25]。并且以這些中間體為合成前體，進行了廣泛的半合成青蒿素的研究，取得了重要的進展。有些半合成青蒿素的產(chǎn)量已經(jīng)無限接近工業(yè)化的水平[40-43]。

2.3 重構(gòu)青蒿素及其中間體代謝途徑的方式多樣

目前主要通過兩種模式在不同的底盤細胞中構(gòu)建青蒿素及其中間體代謝途徑。第一種模式是青蒿素及其中間體固有代謝途徑的轉(zhuǎn)移、重構(gòu)與工程化，這種模式是建立在青蒿素代謝途徑的深刻解析的基礎(chǔ)之上，是青蒿素合成生物學(xué)研究中主要的模式。這種模式的主要特點是重構(gòu)的青蒿素及其中間體的代謝途徑與原植物中的代謝途徑基本保持一致。通過這種模式構(gòu)建的青蒿素及其中間體工程化生物系統(tǒng)中，一種方式是只導(dǎo)入了青蒿素生物合成特異途徑中的基因，利用底盤細胞中固有的底物供應(yīng)途徑，便可達到制備青蒿素中間體的目的（圖2）。這種構(gòu)建方式主要是基于基因工程的原理設(shè)計的。和別的重構(gòu)方式相比，這種方式相對較為簡單。這種青蒿素及其中間體工程系統(tǒng)的構(gòu)建理念被廣泛地運用到了不同的底盤細胞中，更主要的目的是想驗證不同代謝途徑在底盤細胞中重構(gòu)的可能性[19-21,50,55,56,63,67,68]。

第二種方式也是利用底盤細胞中固有的底物供應(yīng)途徑，和第一種方式不同的是除了導(dǎo)入青蒿素生物合成特異基因之外，還導(dǎo)入了底物供應(yīng)途徑的限速酶基因，通過增加這些限速酶基因的拷貝數(shù)，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量（圖3）。和第一種方式相比，通過這種方式構(gòu)建工程菌時，在基因工程的原理上引入了模塊化設(shè)計的理念。這樣構(gòu)建的工程菌中，一般含有兩個模塊，即青蒿素及其中間體合成模塊與萜類前體調(diào)控模塊。組成這兩個模塊的基因一般分處在不同的質(zhì)粒上[44-47,51,52,54,62]，但考慮到底盤細胞的代謝負擔(dān)，這兩個模塊的基因有時候也克隆在同一載體上[47,70]。自然界主要存在兩條萜類前體供應(yīng)的途徑，根據(jù)萜類前體調(diào)控模塊將這種方式的工程菌分為兩大類，即含DXP途徑調(diào)控模塊的工程菌和含MVA途徑調(diào)控模塊的工程菌。Martin等[44]構(gòu)建了一種紫穗槐-4,11-二烯E.coli工程菌，除了導(dǎo)入ADS基因之外，還導(dǎo)入了含DXP途徑的3個限速酶基因的模塊，導(dǎo)致目的產(chǎn)物紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量提高了3.6倍。2006年，Ro等[22]構(gòu)建了以釀酒酵母為底盤細胞的青蒿酸工程菌，在該工程菌中，除了導(dǎo)入了含青蒿酸生物合成特異基因的模塊之外，還導(dǎo)入了含MVA途徑基因的調(diào)控模塊，通過調(diào)控模塊的作用，使工程菌中青蒿酸的產(chǎn)量大幅提升，達到115 mg·L-1。除此之外，還有很多實驗室構(gòu)建的工程菌都采用了這種青蒿素及其中間體合成模塊與MVA 途徑調(diào)控模塊共轉(zhuǎn)化的模式，如Kong等[37,62]、Wu等[50]、van Herpen等[69]以及Farhi等[70]等構(gòu)建的工程菌。

第三種方式是另外導(dǎo)入一條底物供應(yīng)途徑，這樣既可以在不需要底盤細胞供應(yīng)底物的情況下，完成青蒿素及其中間體的制備，也可以同時利用底盤細胞固有的底物供應(yīng)途徑和引入的底物供應(yīng)途徑提供的底物制備青蒿素及其中間體。和前兩種方式相比，這種方式通過模塊化的設(shè)計導(dǎo)入更多的基因，給底盤細胞帶來的代謝負擔(dān)最重，因此，在操作上更為繁雜。這種構(gòu)建工程菌的方式融入了工程化思想，使得重構(gòu)的代謝途徑成為一條可拆卸的即插即用的“電路”（圖 4）。2003年，美國伯克利分校的 Keasling課題組構(gòu)建了一個能制備紫穗槐-4,11-二烯的E.coli工程菌，在這個工程菌中，導(dǎo)入了3個模塊，即甲羥戊酸合成模塊（頂部模塊，top module）、FPP合成模塊（bottom module）和紫穗槐-4,11-二烯合成模塊[44]。這3個模塊都由一些可拆卸的即插即用的元件構(gòu)成，因此，既可以方便地對模塊中的元件進行優(yōu)化[54]，也能便捷地將這些模塊用于其他代謝途徑的構(gòu)建[52]，將眾多復(fù)雜的生物合成途徑演變成了可隨時拆卸用的工程化生物系統(tǒng)。此后的很多學(xué)者也采用了類似的方法構(gòu)建了不同的青蒿素及其中間體工程化系統(tǒng)[52]。

在底盤細胞中構(gòu)建青蒿素及其中間體代謝途徑的第二種模式是全新青蒿素及其中間體合成途徑的設(shè)計、篩選、組裝與程序化。這種模式是根據(jù)青蒿素及其中間體的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計的一條合成路線。根據(jù)這條合成路線從基因數(shù)據(jù)庫中篩選出能參與設(shè)計好的合成路線的酶基因，并將這些酶基因?qū)氲妆P細胞中，在底盤細胞中組裝成一條新的青蒿素及其中間體的合成路線。這樣構(gòu)建的青蒿素及其中間體的合成路線和原植物中的合成路線明顯不同，它是建立在深厚的化學(xué)和生物功底的基礎(chǔ)之上，不需要詳細了解青蒿素在原植物中的合成路線。Dietrich等[65]構(gòu)建了一個能制備artemisinic-11S，12-epoxide的大腸桿菌工程菌，在這個工程菌中，除了導(dǎo)入能合成紫穗槐-4,11-二烯的操縱子之外，還導(dǎo)入了一個突變的長鏈脫氫酶基因 P450BM3，這樣構(gòu)建的代謝途徑并不是青蒿中存在的，然而，利用這樣構(gòu)建的工程菌產(chǎn)生的artemisinic-11S，12-epoxide 為底物，通過半合成的方法卻能制備得到青蒿素的直接前體二氫青蒿酸。

3 提高工程菌中目的產(chǎn)物產(chǎn)量的措施

3.1 通過“開源”方式增加前體供應(yīng)

青蒿素是一種倍半萜，其生物合成包括兩部分（圖1）。上游部分（top pathway）主要指倍半萜共同前體FPP的形成。通過MEP和MVA兩條途徑形成的FPP池可以為下游各種倍半萜以及甾體提供前體物質(zhì)。下游部分（bottom pathway）是青蒿素生物合成的特異途徑，即在ADS的競爭作用下，將上游途徑中形成的FPP池中的部分FPP引入青蒿素生物合成代謝流中。因此，為了提高工程菌中青蒿素或其中間體的產(chǎn)量，就必須將更多的前體FPP導(dǎo)入青蒿素生物合成的特異途徑中?？傮w來看，現(xiàn)在實現(xiàn)這一目的的方式主要采用“開源”和“節(jié)流”兩種。所謂“開源”，是指提高工程菌的FPP池中底物的總量，從而提高進入青蒿素生物合成途徑的底物的絕對總量，這是提高工程菌產(chǎn)量的主要方式，包括提高FPP形成途徑中各個途徑酶的效率，如增加基因拷貝數(shù)、對啟動子進行修飾、密碼子優(yōu)化、基因替換、調(diào)控輔酶數(shù)量以及選擇不同區(qū)室等；或者通過優(yōu)化或平衡多基因控制的代謝途徑實現(xiàn)底物供應(yīng)的增量。而“節(jié)流”則是限制或減少底物流向別的代謝流，促使相對更多的FPP進入青蒿素生物合成特異途徑。在青蒿素工程菌優(yōu)化過程中，這兩種方式既可以單獨應(yīng)用，也可以聯(lián)合應(yīng)用。

3.1.1 增加基因的拷貝數(shù)

增加FPP合成途徑中酶基因的拷貝數(shù)，能有效地增加底物的供應(yīng)，這個觀點已經(jīng)為很多實驗所證明。為了提高DXP途徑合成FPP的效率，Martin等[44]在工程菌中導(dǎo)入了含DXP途徑關(guān)鍵酶基因的質(zhì)粒，通過增加這些限速酶的基因拷貝數(shù)，使得構(gòu)建的工程菌產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量高于對照。為了增加重構(gòu)青蒿酸代謝途徑中底物FPP的供應(yīng)，Ro等[22]在釀酒酵母工程細胞中增加了MVA途徑的限速酶基因HMGR和FPPS的拷貝數(shù)，使得青蒿酸的產(chǎn)量顯著上升。Pitera等[46]通過采用將途徑酶基因克隆到多拷貝的表達質(zhì)粒上的方式，增加途徑酶基因的拷貝數(shù)，從而有效地增加了工程菌中底物的供應(yīng)?？捉◤姷萚62]的實驗也表明，增加甲羥戊酸途徑中的HMGR和FPPS編碼基因的拷貝數(shù)，能有效地提高紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量。這種方法操作性很強，而且效果很直接，因此很多實驗室都采用了增加基因拷貝數(shù)的策略來提高重構(gòu)生物系統(tǒng)中底物的供應(yīng)，進而提高工程菌中目的產(chǎn)物產(chǎn)量[46,50,66,70]。

除了通過增加途徑酶基因的拷貝數(shù)來提高酶催化的效率之外，通過調(diào)控因子間接地促進這些途徑酶基因的表達效率也是青蒿素合成生物學(xué)中比較常用的一種方法。UPC2是一種轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)控甾體生物合成途徑中的許多酶基因表達，也包括FPP 生物合成途徑中的部分酶基因。因此，過表達upc2，能有效地增加FPP生物合成途徑中的許多酶基因的轉(zhuǎn)錄，進一步提高他們的表達效率，增加FPP的供應(yīng)，有效地改善工程菌中紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸的產(chǎn)量[22]。

3.1.2 啟動子修飾

啟動子的強弱能有效地影響基因表達的效率。Pitera等[46]通過將甲羥戊酸生物合成相關(guān)操縱子的Lac 啟動子替換成強啟動子araBAD后，導(dǎo)致甲羥戊酸積累。Anthony等[47]的實驗也證明，采用強啟動子時，甲羥戊酸生物合成相關(guān)操縱子的表達確實加強，導(dǎo)致紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量顯著提高。Redding-Johanson等[51]的實驗進一步表明，使用強啟動子能增加甲羥戊酸激酶和磷酸甲羥戊酸激酶的表達活性，進而提高工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量。相對于上述采用強啟動子調(diào)控部分途徑酶基因的轉(zhuǎn)錄相比，Westfall等[41]對整條代謝途徑的途徑酶基因都采用強啟動子進行過表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這樣的效果更佳，和前者相比，整條代謝途徑都過表達的工程菌產(chǎn)生的青蒿酸產(chǎn)量提高了2倍，而紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量更提高了5倍。

除了通過強啟動子調(diào)控途經(jīng)酶基因的效率之外，將含啟動子的不同基因的表達盒轉(zhuǎn)錄方向置于相反的方向，可以有效地避免因為啟動子序列相同而導(dǎo)致的基因重組，保證其調(diào)控的基因能有效地轉(zhuǎn)錄[41]。

3.1.3 密碼子優(yōu)化通過優(yōu)化

FPP形成途徑中的途徑酶的密碼子，顯著增加其表達，增加底物供應(yīng)，也是一種方法。Anthony等[47]將FPP生物合成途徑中的途徑酶基因進行優(yōu)化，由此構(gòu)建的工程菌中紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量提高明顯。Redding-Johanson等[51]也證實了通過優(yōu)化甲羥戊酸激酶和磷酸甲羥戊酸激酶編碼基因而使這兩個基因在工程菌中的表達活性上升，導(dǎo)致了紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量的提升。然而，不是所有途徑酶基因優(yōu)化都能得到預(yù)期的效果。Anthony等[47]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲羥戊酸生物合成相關(guān)操縱子以及甲羥戊酸激酶被優(yōu)化后，都會引起產(chǎn)物上升，而對MBIS 操縱子進行密碼子優(yōu)化，效果不是很明顯。

3.1.4 基因替換

青蒿素是通過萜類途徑提供前體，而萜類生物合成途徑廣泛地存在于各種生物中，因此，不同生物中存在各種不同的萜類生物合成相關(guān)的酶基因，不同生物中的同工酶作用也有強弱之分，為了增加重構(gòu)的代謝途徑中的酶的催化效率，使用活性更強的同工酶替換原來代謝途徑中的酶也是提高蛋白表達豐度，增強其催化效率，進而提高底物供應(yīng)的一種方法。由于代謝途徑中積累過多的HMG-CoA會導(dǎo)致細胞生長，不利于目的產(chǎn)物的制備，為了將更多的HMG-CoA引入青蒿素生物合成特異途徑，2011年Ma等[54]對該工程菌中甲羥戊酸合成模塊中的HMGR基因元件進行功能替代分析時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用來自Delftia acidovorans的HMGR基因元件替代原代謝途徑中的HMGR元件后，引起HMG-CoA含量上升，從而提高AD產(chǎn)量。Tsuruta等[40]進一步對該工程菌進行研究表明，當(dāng)用來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的HMGR和HMGS兩個基因元件取代工程菌中甲羥戊酸代謝模塊中的HMGR和HMGS元件后，該工程菌中紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量也會顯著上升。

3.1.5 增加輔酶數(shù)量

萜類生物合成途徑中有許多酶發(fā)揮作用都需要輔酶的參與，增加這些輔酶的數(shù)量也能顯著提高途徑酶的催化效率。Ma等[54]的實驗表明，通過增加HMGR輔酶NADH的數(shù)量，能顯著提高HMGR的催化效率，促使更多的HMG-CoA生物合成AD。

3.1.6 選擇不同的區(qū)室

這種策略主要針對以植物為底盤細胞的合成生物學(xué)研究。植物中存在兩條萜類生物合成途徑，細胞質(zhì)中主要是 MVA途徑發(fā)揮作用，而質(zhì)體主要通過MEP途徑供應(yīng)前體，在這兩條途徑的作用下，在不同的區(qū)室形成了含量有差異的萜類前體池。當(dāng)將不同的萜類生物合成途徑導(dǎo)向不同的區(qū)室時，由于前體供應(yīng)的差異，使得萜類產(chǎn)物的產(chǎn)量也有很大不同。Wu等[66]通過研究表明，導(dǎo)向質(zhì)體的紫穗槐-4,11-二烯代謝途徑產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量比導(dǎo)向細胞質(zhì)中的紫穗槐-4,11-二烯代謝途徑產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量高40000倍，達到了25 μg·g-1鮮重。隨后，Zhang等[68]的實驗也支持了這個結(jié)論。Farhi等[70]的實驗進一步表明，導(dǎo)向線粒體的青蒿素代謝途徑產(chǎn)生的青蒿素和紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量比導(dǎo)向細胞質(zhì)中的青蒿素代謝途徑產(chǎn)生的青蒿素和紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量都要高，而且增加的幅度很大。上述實驗結(jié)果表明，選擇合適的區(qū)室對于達成通過合成生物學(xué)規(guī)模化制備青蒿素及其中間體的目的具有很重要的意義。

3.1.7 優(yōu)化或平衡多基因控制的代謝途徑

提高途徑酶基因的表達，確實能改善其催化效率，然而對于多基因控制的整條代謝途徑而言，局部的改善產(chǎn)生的效果并不理想。局部的改善往往導(dǎo)致代謝中間產(chǎn)物的積累，進而使細胞產(chǎn)生負擔(dān)，導(dǎo)致毒性，抑制其生長，不利于代謝目的產(chǎn)物的獲得。Keasling課題組在對2003年構(gòu)建的大腸桿菌工程菌進行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，過表達甲羥戊酸生物合成模塊，會導(dǎo)致HMG-CoA積累，從而抑制細胞生長，反而不利于目的產(chǎn)物的產(chǎn)生。而增加HMG-CoA還原酶的拷貝數(shù)，消耗過多的HMG-CoA能恢復(fù)細胞的生長，這種現(xiàn)象說明平衡異源代謝流對于提高工程菌中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量至關(guān)重要[46]。Pfleger等[53]構(gòu)建一種基于基因間隔區(qū)（intergenic regions）文庫的篩選方法，實現(xiàn)對操縱子多個基因協(xié)同調(diào)控，解決異源代謝途徑的平衡問題。綜上所述，通過代謝流控制分析[48,49]，實現(xiàn)代謝途徑平衡運行，進而有效地高產(chǎn)制備目的產(chǎn)物是青蒿素合成生物學(xué)的終極目標(biāo)之一。

3.2 通過“節(jié)流”方式增加前體供應(yīng)

除了增加FPP的絕對供應(yīng)總量之外，減少FPP池中的前體流入其他倍半萜代謝途徑，促使相對更多的前體流入青蒿素及其中間體生物合成的特異途徑也是有效提高其產(chǎn)量的方法。這些節(jié)流措施主要包括抑制或下調(diào)競爭代謝途徑，從而限制或減少流入競爭代謝途徑中的FPP供應(yīng)。如為了提高進入青蒿酸生物合成途徑的FPP的流量，Ro等[22]和Paradise等[58]都通過下調(diào)競爭性甾體合成途徑中的ERG9基因的表達，減少進入甾體生物合成途徑中的FPP代謝流，從而相對增加進入青蒿酸生物合成途徑的FPP流量，進而增加目的產(chǎn)物紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸的產(chǎn)量。Lenihan等[42]的實驗也證明，下調(diào)ERG9基因的表達，確實能增加代謝產(chǎn)物青蒿酸的產(chǎn)量。

3.3 提高底物利用效率

提高了底物的供應(yīng)量，并不一定能顯著提高工程化底盤細胞中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。要想使底物數(shù)量的變化在產(chǎn)物產(chǎn)量上有所體現(xiàn)，關(guān)鍵還是取決于重構(gòu)的代謝途徑對底物的利用效率。在青蒿素代謝途徑中，底物利用主要通過青蒿素生物合成特異途徑來完成。因此，工程化底盤細胞能否獲得高產(chǎn)的目的代謝產(chǎn)物，取決于青蒿素生物合成特異途徑的效率。提高青蒿素生物合成特異途徑中的途徑酶效率，主要通過兩種方式，即提高單個基因效率和優(yōu)化平衡整條途徑來實現(xiàn)這個目的。對于單個基因效率的提高，主要采取增加基因拷貝數(shù)、密碼子優(yōu)化、強啟動子調(diào)控和融合基因等方式。對于代謝途徑的平衡優(yōu)化，主要采用一種基于全局的數(shù)學(xué)算法和生物信息分析，如代謝流控制分析。相對于單個基因效率的提高，整條代謝途徑的平衡優(yōu)化顯得更為困難和復(fù)雜，對最終產(chǎn)物產(chǎn)量的影響也是最深刻和直接的。

3.3.1 增加基因拷貝數(shù)

增加代謝途徑中目的基因拷貝數(shù)，通過過表達該基因能有效地增加產(chǎn)物的產(chǎn)量。Lindahl等[57]和Kong等[56,63]都證明，增加釀酒酵母工程菌中ADS基因的拷貝數(shù)，能提高紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量。Anthony等[47]的實驗也表明，減少工程菌中ADS基因的拷貝數(shù)，紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量也會因此而顯著降低。

3.3.2 密碼子優(yōu)化

采用宿主偏愛的密碼子，減少或避免使用稀有密碼子是提高途徑酶基因異源表達水平的重要手段。為了增加紫穗槐-4,11-二烯合酶基因在大腸桿菌中的表達，Martin等[44]將ADS基因突變成用大腸桿菌偏愛密碼子表示的序列，并將其導(dǎo)入大腸桿菌，對獲得的工程菌進行發(fā)酵表明，ADS的表達顯著增強，產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量明顯提高。

Kong等[61]通過連續(xù)重疊PCR的方法，獲得了完全用釀酒酵母偏愛密碼子表示的ADS基因，含有該基因的酵母工程菌產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量比對照提高了10～20倍。該結(jié)果再次表明，優(yōu)化途徑酶基因的密碼子是有效改善其表達水平的途徑之一。然而，如果將參與青蒿酸生物合成的3個基因ADS、CYP71AV1和CPR都采用釀酒酵母偏愛密碼子表示的序列，這樣構(gòu)建的工程菌產(chǎn)生的青蒿酸產(chǎn)量沒有顯著變化，上述結(jié)果說明，多個基因優(yōu)化并不是多個單一基因優(yōu)化的簡單總和，詳細的機制目前并不清楚[41]。

3.3.3 啟動子修飾

除了使用強啟動子調(diào)控途徑酶基因的表達外，為了減少異源多基因控制的代謝途徑在底盤細胞中發(fā)生基因重組而導(dǎo)致基因沉默的情況發(fā)生，將構(gòu)成同一代謝途徑的不同基因通過不同的啟動子進行調(diào)控能有效地規(guī)避這個不利現(xiàn)象的發(fā)生。Farhi等[70]利用不同的啟動子和終止子對青蒿素生物合成途徑酶基因進行調(diào)控，在煙草細胞中有效地合成出了青蒿素。

3.3.4 基因替換

Chang等[52]的實驗表明，當(dāng)CYP71AV1的N 末端跨膜序列被假絲酵母（Candida tropicalis）的P450跨膜序列取代時，或者CYP的N末端跨膜序列被假絲酵母的CPR跨膜序列取代時，工程菌中代謝產(chǎn)物出現(xiàn)了差異。

3.3.5 增加基因之間的偶聯(lián)效率

在青蒿素生物合成途徑中，P450氧化酶CYP71AV1及其電子配偶體CPR的偶聯(lián)對代謝途徑的影響比較顯著。Zhang等[68]在N.tabacum中導(dǎo)入了青蒿素生物合成相關(guān)的基因：FPPS、ADS、CYP71AV1和Dbr2，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草中積累青蒿醇和二氫青蒿醇，并沒有檢測到預(yù)計的青蒿酸和二氫青蒿酸的生成。據(jù)此推斷，煙草的內(nèi)環(huán)境更適于醛的還原，而且植物內(nèi)生的乙醇脫氫酶活性要強于CYP71AV1的青蒿醇和青蒿醛氧化酶活性，從而促使CYP71AV1氧化形成的青蒿醛還原成青蒿醇，或者將Dbr2催化形成的二氫青蒿醛還原成二氫青蒿醇。另外Farhi等[70]也利用了N.tabacum進行了合成青蒿素及其中間體的嘗試，他們在N.tabacum中除了導(dǎo)入上述4個基因之外，還導(dǎo)入HMGR和CPR兩個基因，結(jié)果表明，通過這種方式構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因煙草中制備出了青蒿素。在這種植物工程系統(tǒng)中，HMGR的導(dǎo)入主要是增加前體的供應(yīng)，而導(dǎo)致產(chǎn)物出現(xiàn)差異的一個重要原因是CPR基因的導(dǎo)入。CPR的導(dǎo)入增加了和CYP71AV1的偶聯(lián)效率，提高了它的氧化效率，有利于氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，進而形成青蒿素。這個結(jié)論在Chang等[52]的實驗中也得到了佐證。Chang等在利用E.coli 制備青蒿酸的實驗中發(fā)現(xiàn)，CYP71AV1和CPR的偶聯(lián)效率要強于CYP71AV1與異源CPR的偶聯(lián)效率，導(dǎo)入了CYP71AV1和CPR的E.coli工程菌產(chǎn)生的青蒿醇產(chǎn)量提高了12倍。

3.3.6 質(zhì)粒替換

質(zhì)粒作為基因的載體被導(dǎo)入不同的工程化細胞，實現(xiàn)多基因控制通路的重構(gòu)與優(yōu)化。因此，質(zhì)粒自身的性質(zhì)對工程化細胞中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量也會有顯著的影響。Chang等[52]的實驗表明，當(dāng)將CYP71AV1克隆pETDUET-1中時，會導(dǎo)致CYP71AV1表達效率降低，從而影響CYP71AV1 的功能，發(fā)酵產(chǎn)物中只能檢測到青蒿醇。而將CYP71AV1克隆到pCWori中時，CYP71AV1的氧化效率顯著增加，直接表現(xiàn)就是青蒿醛和青蒿酸出現(xiàn)在發(fā)酵產(chǎn)物中。

此外，工程菌中質(zhì)粒之間的兼容性對產(chǎn)物的產(chǎn)量也具有很大的影響[47]。

3.3.7 底盤細胞替換

作為天然產(chǎn)物的生產(chǎn)場所，底盤細胞性質(zhì)的差異對目的產(chǎn)物也會造成非常大的影響，主要體現(xiàn)在產(chǎn)量和性質(zhì)兩個方面。除了在分類上屬于不同界的底盤細胞，如植物、釀酒酵母和大腸桿菌產(chǎn)生的產(chǎn)物會出現(xiàn)差異之外，同一個種的底盤細胞，即便只是基因型出現(xiàn)差異，產(chǎn)生目的產(chǎn)物的能力也會顯著不同。Chang等[52]的實驗表明，和DH10B相比，采用DH1作為宿主菌，能顯著增加紫穗槐-4,11-二烯的的氧化效率。

3.4 優(yōu)化培養(yǎng)和生產(chǎn)條件

除了對青蒿素代謝途徑自身進行優(yōu)化外，培養(yǎng)條件對工程菌中青蒿素及其前體的產(chǎn)量也有相當(dāng)大的影響。根據(jù)紫穗槐-4,11-二烯容易揮發(fā)的特點，Keasling實驗室認為2003年的實驗有可能低估了紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量[44]，因此，他們利用兩相分配生物反應(yīng)器（two-phase partitioning bioreactor，TPPB）來制備紫穗槐-4,11-二烯，結(jié)果表明，加入有機相后，紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量顯著增加，達到0.48 g·L-1[45]。但這種兩相分配生物器不是對所有青蒿素及其中間體工程菌的發(fā)酵都適用，Chang等[52]在發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌工程菌生產(chǎn)青蒿酸時發(fā)現(xiàn)，去掉有機相覆蓋層，會顯著促進青蒿酸產(chǎn)量上升，這就表明任何一個外界條件都有一定的適用范圍，條件優(yōu)化應(yīng)該根據(jù)對象進行設(shè)計。

考慮到二氫青蒿酸通過光氧化能自發(fā)地形成青蒿素，F(xiàn)arhi等[70]在培養(yǎng)導(dǎo)入了ADS、tHMGR、CYP71AV1、CPR和DBR2 5個基因的植物細胞生產(chǎn)系統(tǒng)時，采用強光培養(yǎng)的方式，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草在強光條件下，確實能將由上述5個酶催化形成的二氫青蒿酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生青蒿素。

除了上述培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基的成分對工程菌發(fā)酵也會產(chǎn)生重大的影響。Martin等[44]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加甘油，會增加工程菌的生物量和紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量。Westfall等[41]證明，將乙醇和葡萄糖作為培養(yǎng)基的混合碳源時，發(fā)酵產(chǎn)生的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量顯著增加。而將碳源變成半乳糖時，發(fā)酵產(chǎn)物中的青蒿酸產(chǎn)量上升明顯[42]。此外，對工程菌進行分批補料發(fā)酵時，對氮源和碳源進行限制[40]，或者對葡萄糖和磷酸鹽進行限制[41]，都能有效增加工程菌的生物量，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。

這些結(jié)果說明提高人工系統(tǒng)制備目的天然產(chǎn)物的能力，必須采用“內(nèi)因”和“外因”協(xié)調(diào)優(yōu)化的方式，即既要對代謝途徑進行系統(tǒng)的優(yōu)化，又必須有針對性的優(yōu)化培養(yǎng)條件，只有這樣，才能以最優(yōu)的方式將工程菌中目標(biāo)代謝物的產(chǎn)量提高到工業(yè)化的水平。

從上面可以看到，經(jīng)過十多年的發(fā)展，通過底盤細胞生產(chǎn)青蒿素及其中間體無論從理論上還是物質(zhì)上都已經(jīng)準(zhǔn)備充分。網(wǎng)絡(luò)上早就有賽諾菲-安萬特公司開始利用工程酵母制備青蒿素的報道，意味著合成生物學(xué)制備的青蒿素正式走向生產(chǎn)。

4 小結(jié)

通過合成生物學(xué)制備青蒿素及其中間體的成功，無論對青蒿素本身還是對未來天然藥物的生產(chǎn)格局都會產(chǎn)生深遠的影響。通過合成生物學(xué)制備青蒿素，不受環(huán)境和土地的制約，能在短時間內(nèi)獲得大量的青蒿素，能穩(wěn)定世界市場上青蒿素的供應(yīng)，有效地降低青蒿素的價格，有利于控制瘧疾在貧困國家的肆虐。青蒿素是醫(yī)藥界的“重磅炸彈”，通過合成生物學(xué)制備青蒿素的成功，其意義可能不止每年幾十億元的銷售額。首先，它對其他稀缺藥物的綠色制備具有借鑒意義，能有效地推動天然藥物的可持續(xù)發(fā)展、能引領(lǐng)其他天然藥物的綠色制備，更重要的是通過合成生物學(xué)制備青蒿素的成功經(jīng)驗和技術(shù)能移植到其他化工產(chǎn)品、能源和材料的合成生物學(xué)研究中，能有效地緩解由于人口劇增帶來的土地供應(yīng)問題以及由于化學(xué)合成及土地施肥造成的環(huán)境污染問題，對于建設(shè)“綠色中國”和“綠色世界”的目標(biāo)都具有非常重要的意義。

摘編自《藥學(xué)學(xué)報》2013年2期：193～205頁，圖、表、參考文獻已省略。