過表達HDR和ADS基因?qū)η噍锼厣锖铣傻挠绊?/h1>
2015-01-30 14:16:40王亞雄龍世平曾利霞向禮恩林智陳敏廖志華
中國學(xué)術(shù)期刊文摘 2015年21期
王亞雄，龍世平，曾利霞，向禮恩，林智，陳敏，廖志華
（1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715；2.四川省眉山第一中學(xué)，四川 眉山 620010；3.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715）
過表達HDR和ADS基因?qū)η噍锼厣锖铣傻挠绊?/p>
王亞雄1，龍世平1，曾利霞2，向禮恩1，林智1，陳敏3，廖志華1
（1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715；2.四川省眉山第一中學(xué)，四川 眉山 620010；3.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715）
青蒿素（Artemisinin）是從草本藥用植物黃花蒿，俗名青蒿（Artemisia annua L.）中分離提取的一種含有過氧橋基團結(jié)構(gòu)的新型倍半萜內(nèi)酯，它是治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾的特效藥物[1]。WHO稱青蒿素為“目前世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”[2]。目前，盡管很多國家已經(jīng)可以防止和治療瘧疾，但全球每年還是會有約一百萬人死于瘧疾，使得青蒿素的需求量很大；同時，青蒿素及其衍生物抗腫瘤活性的發(fā)現(xiàn)[3,4]，使得青蒿素的市場前景更加廣闊。Keasling[5,6]實驗小組在酵母中重建代謝青蒿素生物合成途徑，成功在其代謝產(chǎn)物中分離提純到了青蒿素合成的前體物質(zhì)，如青蒿酸、二氫青蒿酸等。通過這一技術(shù)生產(chǎn)的青蒿素將會成為市場供不應(yīng)求狀況下的一個良好補充，然而農(nóng)業(yè)種植依然是青蒿素最根本的供應(yīng)源。發(fā)展中國家通常采用農(nóng)業(yè)種植青蒿并從中提取青蒿素以治療瘧疾，為發(fā)展中國家農(nóng)民提供高產(chǎn)青蒿素的青蒿能夠降低青蒿素的生產(chǎn)成本，穩(wěn)定市場供應(yīng)量，為農(nóng)民帶來直接經(jīng)濟利益，增加農(nóng)民種植青蒿的信心[7]。目前，青蒿仍然是青蒿素唯一資源植物，但青蒿素含量較低，而且青蒿素價格相對較高，這使得青蒿素生產(chǎn)不能滿足市場需求[8]。因而培育青蒿素高產(chǎn)青蒿成為該行業(yè)共同追求的目標，而植物代謝工程是遺傳改良青蒿素生物合成途徑、培育青蒿素高產(chǎn)青蒿的有效方法之一。
青蒿素生物合成途徑已經(jīng)基本闡明，途徑中涉及到的結(jié)構(gòu)基因大多已經(jīng)克隆鑒定，為采用代謝工程方法培育青蒿素高產(chǎn)青蒿提供了基因資源。青蒿素可由位于植物質(zhì)體的MEP途徑提供基本5碳前體異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）及其同分異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyldiphosphate，DMAPP），該途徑中最后一步酶促反應(yīng)是由羥甲基丁烯基-4-磷酸還原酶（hydroxymethylbutenyl4-diphosphate reductase，HDR）催化羥甲基丁烯基-4-磷酸還原生成IPP和DMAPP。HDR是MEP途徑中的關(guān)鍵酶，也是遺傳改造MEP途徑重點考慮的靶點，本實驗室報道了青蒿HDR基因可用于遺傳改造青蒿MEP途徑[9]。紫穗槐二烯合成酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）催化15碳的法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP）環(huán)化生成紫穗槐二烯；紫穗槐二烯為青蒿素生物合成提供獨有的倍半萜骨架[10]。ADS催化的環(huán)化反應(yīng)是青蒿素生物合成途徑限速反應(yīng)，ADS是青蒿素生物合成途徑中重要的關(guān)鍵酶[11]。
本文采用雙基因共轉(zhuǎn)化策略，在青蒿中同時過表達青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因HDR和ADS，以期打破青蒿素生物合成途徑中瓶頸反應(yīng)步驟，探討HDR和ADS基因過表達在青蒿素合成中的作用，并為青蒿素生產(chǎn)提供青蒿素高含量轉(zhuǎn)基因青蒿。
材料與方法
1 植物材料
青蒿種子來自于重慶酉陽青蒿生產(chǎn)基地，播種于西南大學(xué)溫室，自主采收成熟種子備用。無菌萌發(fā)青蒿種子，作為實驗材料。
2 菌株和質(zhì)粒
大腸桿菌DH5α和土壤根癌農(nóng)桿菌LBA4404保存于-80℃；植物高效表達載體p1304+[12]由本實驗室廖志華教授改造獲得。
3 總RNA提取及cDNA合成
葉片總RNA提取使用TIANGEN公司的RNAsimple Total RNA Kit試劑盒，紫外分光光度計測定其在260 nm和280 nm處的吸光度，A260/A280均大于1.8小于2.1，表明RNA無蛋白和DNA污染，將質(zhì)量合格的RNA用TaKaRaRNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒進行第一鏈cDNA的合成用于基因克隆。
4 載體構(gòu)建及工程菌的獲得
根據(jù)已報道的HDR基因（GenBank:GQ119345）和ADS基因（GenBank：HQ315833）設(shè)計特異引物（表1），fhdr帶有酶切位點SpeⅠ，rhdr帶有酶切位點NheⅠ；fads帶有酶切位點BamHⅠ，rads帶有酶切位點SacⅠ。用這兩對引物從青蒿中克隆得到HDR和ADS基因的編碼區(qū)序列，并將其構(gòu)建到植物高效表達載體p1304+上，獲得命名為p1304+-ADS-HDR的質(zhì)粒（圖1）。用p1304+-ADS-HDR轉(zhuǎn)化土壤根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞，最終獲得目標工程菌LBA4404-p1304+-ADS-HDR。
5 青蒿的遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測
取青蒿無菌苗幼嫩葉片作為外植體，用工程菌LBA4404-p1304+-ADS-HDR轉(zhuǎn)化青蒿葉盤，在MS+1.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+10 mg·mL-1潮霉素+250 mg·L-1頭孢菌素固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周左右可獲得潮霉素抗性再生芽。除菌完全的株系用SDS法抽提基因組DNA，PCR檢測潮霉素抗性基因（Hygr）和目的基因HDR與ADS，為避免擴增出青蒿內(nèi)源的HDR和ADS基因造成假陽性，檢測這兩個基因所用的正向引物在CaMV 35S啟動子區(qū)設(shè)計（F35S），反向引物分別為Rhdr和Rads；檢測潮霉素抗性基因引物為FHygr和RHygr，相關(guān)引物序列見表2。加樣體系：2.5 μL 10×PCR Buffer、1.5 μL 25 mmol·L-1MgCl2、2.0 μL 25mmol·L-1dNTP、0.5 μL上游引物（10 μmol·L-1）、0.5μL下游引物（10 μmol·L-1）、0.75 μL DNA模板、0.25μL Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）和17.0 μL ddH2O，總體積25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性8 min，30個循環(huán)（94℃變性30 s，退火58℃（Hygr），55℃（HDR），58℃（ADS），退火時間為30 s，72℃延伸1 min），最后72℃后延伸5 min。
6 青蒿素提取及HPLC-ELSD法檢測
取青蒿組織于烘箱中45℃恒溫干燥至恒重。將烘干的青蒿組織研磨成粉，按向禮恩[13]、張東[14]和Lu[15]等的方法提取青蒿素，并檢測青蒿素含量，青蒿素標準品購自Sigma公司，每個轉(zhuǎn)基因青蒿單克隆設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。色譜條件：色譜柱為Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm）；流動相為乙腈（acetonitrile）和水（體積比為60∶40）；流速為1 mL·min-1；蒸發(fā)光散射檢測儀（增益為8）；載氣為純度0.999氮氣；柱溫箱溫度為40℃。進樣量為20 μL，每個樣品重復(fù)進樣3次。
7 引物設(shè)計與qRT-PCR
根據(jù)青蒿HDR和ADS序列，使用Beacon designer 2.06軟件設(shè)計qPCR引物，見表3。使用IQ5 Multicolor Real-Time PCR儀，參照SYBRR Premix ExTaqTMII（Perfect Real Time）試劑盒說明書進行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBRPremix ExTaqTM、0.8 μL上游引物（10 μmol·L-1）、0.8 μL下游引物（10 μmol·L-1）、0.7 μL cDNA模板和7.7 μL RNase-Free H2O，總體積20 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s，接著進行35個擴增循環(huán)（95℃ 5 s，退火30 s，72℃ 20 s，延伸結(jié)束后采集熒光），退火溫度ADS為61℃，HDR為61℃，β-actin為61℃；融解曲線分析：60℃到95℃逐漸升溫，每間隔0.5℃保溫10 s，采集一次熒光。以β-actin基因作為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct方法計算各基因的相對表達量。
結(jié)果與分析
1 轉(zhuǎn)基因青蒿的獲得與分子鑒定
p1304+質(zhì)粒上T-DNA區(qū)攜帶有潮霉素抗性基因，所以經(jīng)工程菌LBA4404-p1304+-ADS-HDR轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)基因青蒿具有潮霉素抗性，能夠在含有潮霉素的培養(yǎng)基上正常生長。葉盤法轉(zhuǎn)化青蒿幼嫩葉片，暗培養(yǎng)2天后，在含有10 mg·L-1潮霉素的再生培養(yǎng)基上進行篩選誘導(dǎo)。4周左右葉片傷口處再生出芽，待其生長到2～3 cm高時剪下，在含有頭孢菌素的MS培養(yǎng)基中進行除菌培養(yǎng)，除菌完全后的植株用于煉苗移栽。轉(zhuǎn)HDR和ADS基因的轉(zhuǎn)基因青蒿在形態(tài)上與非轉(zhuǎn)基因青蒿沒有明顯區(qū)別（圖2）。基因組PCR結(jié)果顯示，在潮霉素抗性篩選獲得的青蒿植株中有6個株系同時檢測到812 bp的潮霉素抗性基因（Hygr）片段、411 bp的ADS（攜帶有部分CaMV 35S啟動子序列）基因片段和236 bp的HDR（攜帶有部分CaMV35S啟動子序列）基因片段（圖3）。基因組PCR檢測最終確認了6個雙基因共轉(zhuǎn)化青蒿株系，其編號依次為ah3、ah11、ah20、ah27、ah28、ah70。
2 青蒿素含量的測定
青蒿素標準品的保留時間為11.7 min（圖4A）。樣品的保留時間為11.6 min（圖4B）。樣品和標準品的保留時間基本一致，表明本研究中在青蒿提取物樣品中檢測到的物質(zhì)為青蒿素。以非轉(zhuǎn)基因青蒿作為對照，對6個轉(zhuǎn)基因青蒿株系進行青蒿素含量分析。結(jié)果顯示，在6個共轉(zhuǎn)化ADS和HDR 轉(zhuǎn)基因青蒿株系中，青蒿素含量都得到不同程度的提高。在6個轉(zhuǎn)基因株系中，ah70株系青蒿素含量最高，達到0.53 mg·g-1DW，為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓曛星噍锼睾浚?.15 mg·g-1DW）的3.48倍（圖5）；其次為ah11株系的青蒿素含量（0.51 mg·g-1DW）提高較多，為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.32倍（圖5）。這兩個株系中青蒿素含量提高倍數(shù)比其他轉(zhuǎn)基因株系中青蒿素含量提高倍數(shù)更為明顯。轉(zhuǎn)基因株系中ah3株系的青蒿素含量（0.27 mg·g-1DW）在所有轉(zhuǎn)基因株系中含量提高最少，為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.78倍（圖5）。另外3個轉(zhuǎn)基因青蒿株系ah20、ah27和ah28中青蒿素含量分別為0.46 mg·g-1DW、0.39 mg·g-1DW和0.47 mg·g-1DW，相對于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ斩加酗@著提高（圖5）。
3 目的基因HDR和ADS相對表達量檢測
采用實時熒光定量PCR檢測目的基因HDR和ADS的相對表達量。實驗結(jié)果顯示，ADS、HDR和β-actin基因的擴增效率分別為92.0%、94.7%、93.5%，都在90%～105%的有效統(tǒng)計范圍內(nèi)[16]；所得標準曲線相關(guān)性系數(shù)R2都在0.99以上，且融解曲線都只有單一的峰，無引物二聚體和非特異擴增，表明內(nèi)參基因β-actin和目的基因ADS和HDR引物均符合實時熒光定量PCR的檢測要求。
在6個共轉(zhuǎn)化HDR和ADS轉(zhuǎn)基因青蒿株系中，HDR基因表達量都比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩蠬DR基因表達量高很多；但不同轉(zhuǎn)基因株系中，HDR基因表達量高低有差異。與對照比較，轉(zhuǎn)基因株系ah20中HDR基因表達量最高，為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.90倍；轉(zhuǎn)基因株系ah28中HDR基因表達量提高最少，為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.73倍（圖6）。HDR基因過表達，有利于打破青蒿素前體依賴于MEP途徑生物合成中的限速反應(yīng)，為青蒿素生物合成提供充足的前體物質(zhì)IPP及其同分異構(gòu)體DMAPP，從而促進青蒿素生物合成[8]。本實驗室先前曾報道過表達MEP途徑中第一個限速酶基因DXR，能夠提高青蒿素含量，首次在轉(zhuǎn)基因水平證明了MEP途徑參與青蒿素生物合成[13]。本研究再次證明了基于MEP途徑中有HDR催化的限速步驟的遺傳改造也能夠調(diào)控青蒿素生物合成。在所有轉(zhuǎn)基因株系中，ADS基因表達量都有顯著提高（轉(zhuǎn)基因株系ah3除外），不同轉(zhuǎn)基因株系中，ADS基因提高幅度差異較大（圖7）。與對照比較，轉(zhuǎn)基因株系ah27中ADS表達量提高最多，為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.07倍；而轉(zhuǎn)基因株系ah3中ADS基因表達與對照比較，沒有顯著性差異（圖7），這有可能是轉(zhuǎn)基因沉默引起的[17]。事實上ah3提供了一個很好的證據(jù)表明，即使是只有HDR基因表達量提高，也能夠?qū)е虑噍锼睾铣傻脑黾?。ADS基因表達量提高，有利于將MEP途徑提供的前體更多的環(huán)化成為青蒿素的倍半萜骨架紫穗槐二烯，從而使得由ADS催化的限速反應(yīng)被打破，導(dǎo)致更多代謝產(chǎn)物向青蒿素合成方向流動，從而增強青蒿素生物合成[18]。
討論
青蒿素具有獨特的藥用功效，但在青蒿中含量卻很低，不同品種的青蒿中青蒿素含量差異很大，為滿足市場對青蒿素的需求，已研究出多種提高青蒿素含量的方法。一是通過傳統(tǒng)的栽培方法提高青蒿素的含量；二是通過植物激素提高青蒿素的含量；三是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高青蒿素的含量。1996年，Vergauwe等[19]首次建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的青蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高青蒿素含量顯示出非常廣闊的前景[20]。青蒿素的代謝途徑現(xiàn)已研究的比較清楚，途徑上關(guān)鍵酶基因都已經(jīng)得到鑒定，使得利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育青蒿素高含量轉(zhuǎn)基因青蒿成為可能。
青蒿素的生物合成途徑屬于典型的植物類異戊二烯代謝途徑。其上游合成途徑有兩條，包括來自細胞質(zhì)中的MVA途徑和來自質(zhì)體中的MEP途徑。二者共同提供類異戊二烯化合物合成的基本單元IPP和DMAPP。其下游合成途徑主要是FPP的環(huán)化和紫穗槐二烯的一系列官能化直至形成終產(chǎn)物青蒿素。青蒿素生物合成上游途徑和下游途徑都涉及到一系列的酶促反應(yīng)步驟，有的反應(yīng)步驟對整條代謝途徑起到?jīng)Q定性作用，是整條途徑代謝流向目標方向的瓶頸，催化限速反應(yīng)的酶就是限速酶。代謝途徑中限速步驟的突破往往能夠增強代謝流往目標產(chǎn)物方向流動，因而限速步驟也就成為了代謝工程中最重要的遺傳改良靶點[21]。打破特定代謝途徑上目標代謝產(chǎn)物生物合成的限速步驟，經(jīng)典的方法是針對特定代謝途徑上的限速步驟，在存在該代謝途徑的植物中過量表達單個或多個限速酶基因，使這些限速酶始終維持較高的表達水平，從而達到打破瓶頸、推動代謝流往目標產(chǎn)物方向流動的目的。過表達限速酶在青蒿素合成途徑代謝工程中也得到了很好應(yīng)用[22]。在青蒿中過表達長春花（Catharanthus roseus L.）的HMGR基因能夠使青蒿素的含量提高22.5%[23]；在青蒿中同時過表達CYP71AV1和CPR基因使青蒿素含量提高38%[13]。在青蒿中同時轉(zhuǎn)入FPS、CYP71AV1和CPR這3個基因能夠使青蒿素含量提高3.6倍[24]。本研究中6個轉(zhuǎn)基因青蒿株系中青蒿素含量與非轉(zhuǎn)基因株系青蒿素含量相比都有不同程度的提高。說明HDR和ADS雙基因共轉(zhuǎn)化方法在一定程度上打破青蒿素生物合成途徑中這兩個限速反應(yīng)步驟，推動代謝流更多的向青蒿素合成方向流動，提高了青蒿素的合成能力，最終表現(xiàn)為青蒿素含量提高。
摘編自《藥學(xué)學(xué)報》2014年第9期：1346～1352頁，圖、表、參考文獻已省略。
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（1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715；2.四川省眉山第一中學(xué)，四川 眉山 620010；3.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715）
青蒿素（Artemisinin）是從草本藥用植物黃花蒿，俗名青蒿（Artemisia annua L.）中分離提取的一種含有過氧橋基團結(jié)構(gòu)的新型倍半萜內(nèi)酯，它是治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾的特效藥物[1]。WHO稱青蒿素為“目前世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”[2]。目前，盡管很多國家已經(jīng)可以防止和治療瘧疾，但全球每年還是會有約一百萬人死于瘧疾，使得青蒿素的需求量很大；同時，青蒿素及其衍生物抗腫瘤活性的發(fā)現(xiàn)[3,4]，使得青蒿素的市場前景更加廣闊。Keasling[5,6]實驗小組在酵母中重建代謝青蒿素生物合成途徑，成功在其代謝產(chǎn)物中分離提純到了青蒿素合成的前體物質(zhì)，如青蒿酸、二氫青蒿酸等。通過這一技術(shù)生產(chǎn)的青蒿素將會成為市場供不應(yīng)求狀況下的一個良好補充，然而農(nóng)業(yè)種植依然是青蒿素最根本的供應(yīng)源。發(fā)展中國家通常采用農(nóng)業(yè)種植青蒿并從中提取青蒿素以治療瘧疾，為發(fā)展中國家農(nóng)民提供高產(chǎn)青蒿素的青蒿能夠降低青蒿素的生產(chǎn)成本，穩(wěn)定市場供應(yīng)量，為農(nóng)民帶來直接經(jīng)濟利益，增加農(nóng)民種植青蒿的信心[7]。目前，青蒿仍然是青蒿素唯一資源植物，但青蒿素含量較低，而且青蒿素價格相對較高，這使得青蒿素生產(chǎn)不能滿足市場需求[8]。因而培育青蒿素高產(chǎn)青蒿成為該行業(yè)共同追求的目標，而植物代謝工程是遺傳改良青蒿素生物合成途徑、培育青蒿素高產(chǎn)青蒿的有效方法之一。
青蒿素生物合成途徑已經(jīng)基本闡明，途徑中涉及到的結(jié)構(gòu)基因大多已經(jīng)克隆鑒定，為采用代謝工程方法培育青蒿素高產(chǎn)青蒿提供了基因資源。青蒿素可由位于植物質(zhì)體的MEP途徑提供基本5碳前體異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）及其同分異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyldiphosphate，DMAPP），該途徑中最后一步酶促反應(yīng)是由羥甲基丁烯基-4-磷酸還原酶（hydroxymethylbutenyl4-diphosphate reductase，HDR）催化羥甲基丁烯基-4-磷酸還原生成IPP和DMAPP。HDR是MEP途徑中的關(guān)鍵酶，也是遺傳改造MEP途徑重點考慮的靶點，本實驗室報道了青蒿HDR基因可用于遺傳改造青蒿MEP途徑[9]。紫穗槐二烯合成酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）催化15碳的法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP）環(huán)化生成紫穗槐二烯；紫穗槐二烯為青蒿素生物合成提供獨有的倍半萜骨架[10]。ADS催化的環(huán)化反應(yīng)是青蒿素生物合成途徑限速反應(yīng)，ADS是青蒿素生物合成途徑中重要的關(guān)鍵酶[11]。
本文采用雙基因共轉(zhuǎn)化策略，在青蒿中同時過表達青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因HDR和ADS，以期打破青蒿素生物合成途徑中瓶頸反應(yīng)步驟，探討HDR和ADS基因過表達在青蒿素合成中的作用，并為青蒿素生產(chǎn)提供青蒿素高含量轉(zhuǎn)基因青蒿。
材料與方法
1 植物材料
青蒿種子來自于重慶酉陽青蒿生產(chǎn)基地，播種于西南大學(xué)溫室，自主采收成熟種子備用。無菌萌發(fā)青蒿種子，作為實驗材料。
2 菌株和質(zhì)粒
大腸桿菌DH5α和土壤根癌農(nóng)桿菌LBA4404保存于-80℃；植物高效表達載體p1304+[12]由本實驗室廖志華教授改造獲得。
3 總RNA提取及cDNA合成
葉片總RNA提取使用TIANGEN公司的RNAsimple Total RNA Kit試劑盒，紫外分光光度計測定其在260 nm和280 nm處的吸光度，A260/A280均大于1.8小于2.1，表明RNA無蛋白和DNA污染，將質(zhì)量合格的RNA用TaKaRaRNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒進行第一鏈cDNA的合成用于基因克隆。
4 載體構(gòu)建及工程菌的獲得
根據(jù)已報道的HDR基因（GenBank:GQ119345）和ADS基因（GenBank：HQ315833）設(shè)計特異引物（表1），fhdr帶有酶切位點SpeⅠ，rhdr帶有酶切位點NheⅠ；fads帶有酶切位點BamHⅠ，rads帶有酶切位點SacⅠ。用這兩對引物從青蒿中克隆得到HDR和ADS基因的編碼區(qū)序列，并將其構(gòu)建到植物高效表達載體p1304+上，獲得命名為p1304+-ADS-HDR的質(zhì)粒（圖1）。用p1304+-ADS-HDR轉(zhuǎn)化土壤根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞，最終獲得目標工程菌LBA4404-p1304+-ADS-HDR。
5 青蒿的遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測
取青蒿無菌苗幼嫩葉片作為外植體，用工程菌LBA4404-p1304+-ADS-HDR轉(zhuǎn)化青蒿葉盤，在MS+1.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+10 mg·mL-1潮霉素+250 mg·L-1頭孢菌素固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周左右可獲得潮霉素抗性再生芽。除菌完全的株系用SDS法抽提基因組DNA，PCR檢測潮霉素抗性基因（Hygr）和目的基因HDR與ADS，為避免擴增出青蒿內(nèi)源的HDR和ADS基因造成假陽性，檢測這兩個基因所用的正向引物在CaMV 35S啟動子區(qū)設(shè)計（F35S），反向引物分別為Rhdr和Rads；檢測潮霉素抗性基因引物為FHygr和RHygr，相關(guān)引物序列見表2。加樣體系：2.5 μL 10×PCR Buffer、1.5 μL 25 mmol·L-1MgCl2、2.0 μL 25mmol·L-1dNTP、0.5 μL上游引物（10 μmol·L-1）、0.5μL下游引物（10 μmol·L-1）、0.75 μL DNA模板、0.25μL Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）和17.0 μL ddH2O，總體積25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性8 min，30個循環(huán)（94℃變性30 s，退火58℃（Hygr），55℃（HDR），58℃（ADS），退火時間為30 s，72℃延伸1 min），最后72℃后延伸5 min。
6 青蒿素提取及HPLC-ELSD法檢測
取青蒿組織于烘箱中45℃恒溫干燥至恒重。將烘干的青蒿組織研磨成粉，按向禮恩[13]、張東[14]和Lu[15]等的方法提取青蒿素，并檢測青蒿素含量，青蒿素標準品購自Sigma公司，每個轉(zhuǎn)基因青蒿單克隆設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。色譜條件：色譜柱為Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm）；流動相為乙腈（acetonitrile）和水（體積比為60∶40）；流速為1 mL·min-1；蒸發(fā)光散射檢測儀（增益為8）；載氣為純度0.999氮氣；柱溫箱溫度為40℃。進樣量為20 μL，每個樣品重復(fù)進樣3次。
7 引物設(shè)計與qRT-PCR
根據(jù)青蒿HDR和ADS序列，使用Beacon designer 2.06軟件設(shè)計qPCR引物，見表3。使用IQ5 Multicolor Real-Time PCR儀，參照SYBRR Premix ExTaqTMII（Perfect Real Time）試劑盒說明書進行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBRPremix ExTaqTM、0.8 μL上游引物（10 μmol·L-1）、0.8 μL下游引物（10 μmol·L-1）、0.7 μL cDNA模板和7.7 μL RNase-Free H2O，總體積20 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s，接著進行35個擴增循環(huán)（95℃ 5 s，退火30 s，72℃ 20 s，延伸結(jié)束后采集熒光），退火溫度ADS為61℃，HDR為61℃，β-actin為61℃；融解曲線分析：60℃到95℃逐漸升溫，每間隔0.5℃保溫10 s，采集一次熒光。以β-actin基因作為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct方法計算各基因的相對表達量。
結(jié)果與分析
1 轉(zhuǎn)基因青蒿的獲得與分子鑒定
p1304+質(zhì)粒上T-DNA區(qū)攜帶有潮霉素抗性基因，所以經(jīng)工程菌LBA4404-p1304+-ADS-HDR轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)基因青蒿具有潮霉素抗性，能夠在含有潮霉素的培養(yǎng)基上正常生長。葉盤法轉(zhuǎn)化青蒿幼嫩葉片，暗培養(yǎng)2天后，在含有10 mg·L-1潮霉素的再生培養(yǎng)基上進行篩選誘導(dǎo)。4周左右葉片傷口處再生出芽，待其生長到2～3 cm高時剪下，在含有頭孢菌素的MS培養(yǎng)基中進行除菌培養(yǎng)，除菌完全后的植株用于煉苗移栽。轉(zhuǎn)HDR和ADS基因的轉(zhuǎn)基因青蒿在形態(tài)上與非轉(zhuǎn)基因青蒿沒有明顯區(qū)別（圖2）。基因組PCR結(jié)果顯示，在潮霉素抗性篩選獲得的青蒿植株中有6個株系同時檢測到812 bp的潮霉素抗性基因（Hygr）片段、411 bp的ADS（攜帶有部分CaMV 35S啟動子序列）基因片段和236 bp的HDR（攜帶有部分CaMV35S啟動子序列）基因片段（圖3）。基因組PCR檢測最終確認了6個雙基因共轉(zhuǎn)化青蒿株系，其編號依次為ah3、ah11、ah20、ah27、ah28、ah70。
2 青蒿素含量的測定
青蒿素標準品的保留時間為11.7 min（圖4A）。樣品的保留時間為11.6 min（圖4B）。樣品和標準品的保留時間基本一致，表明本研究中在青蒿提取物樣品中檢測到的物質(zhì)為青蒿素。以非轉(zhuǎn)基因青蒿作為對照，對6個轉(zhuǎn)基因青蒿株系進行青蒿素含量分析。結(jié)果顯示，在6個共轉(zhuǎn)化ADS和HDR 轉(zhuǎn)基因青蒿株系中，青蒿素含量都得到不同程度的提高。在6個轉(zhuǎn)基因株系中，ah70株系青蒿素含量最高，達到0.53 mg·g-1DW，為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓曛星噍锼睾浚?.15 mg·g-1DW）的3.48倍（圖5）；其次為ah11株系的青蒿素含量（0.51 mg·g-1DW）提高較多，為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.32倍（圖5）。這兩個株系中青蒿素含量提高倍數(shù)比其他轉(zhuǎn)基因株系中青蒿素含量提高倍數(shù)更為明顯。轉(zhuǎn)基因株系中ah3株系的青蒿素含量（0.27 mg·g-1DW）在所有轉(zhuǎn)基因株系中含量提高最少，為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.78倍（圖5）。另外3個轉(zhuǎn)基因青蒿株系ah20、ah27和ah28中青蒿素含量分別為0.46 mg·g-1DW、0.39 mg·g-1DW和0.47 mg·g-1DW，相對于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ斩加酗@著提高（圖5）。
3 目的基因HDR和ADS相對表達量檢測
采用實時熒光定量PCR檢測目的基因HDR和ADS的相對表達量。實驗結(jié)果顯示，ADS、HDR和β-actin基因的擴增效率分別為92.0%、94.7%、93.5%，都在90%～105%的有效統(tǒng)計范圍內(nèi)[16]；所得標準曲線相關(guān)性系數(shù)R2都在0.99以上，且融解曲線都只有單一的峰，無引物二聚體和非特異擴增，表明內(nèi)參基因β-actin和目的基因ADS和HDR引物均符合實時熒光定量PCR的檢測要求。
在6個共轉(zhuǎn)化HDR和ADS轉(zhuǎn)基因青蒿株系中，HDR基因表達量都比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩蠬DR基因表達量高很多；但不同轉(zhuǎn)基因株系中，HDR基因表達量高低有差異。與對照比較，轉(zhuǎn)基因株系ah20中HDR基因表達量最高，為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.90倍；轉(zhuǎn)基因株系ah28中HDR基因表達量提高最少，為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.73倍（圖6）。HDR基因過表達，有利于打破青蒿素前體依賴于MEP途徑生物合成中的限速反應(yīng)，為青蒿素生物合成提供充足的前體物質(zhì)IPP及其同分異構(gòu)體DMAPP，從而促進青蒿素生物合成[8]。本實驗室先前曾報道過表達MEP途徑中第一個限速酶基因DXR，能夠提高青蒿素含量，首次在轉(zhuǎn)基因水平證明了MEP途徑參與青蒿素生物合成[13]。本研究再次證明了基于MEP途徑中有HDR催化的限速步驟的遺傳改造也能夠調(diào)控青蒿素生物合成。在所有轉(zhuǎn)基因株系中，ADS基因表達量都有顯著提高（轉(zhuǎn)基因株系ah3除外），不同轉(zhuǎn)基因株系中，ADS基因提高幅度差異較大（圖7）。與對照比較，轉(zhuǎn)基因株系ah27中ADS表達量提高最多，為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.07倍；而轉(zhuǎn)基因株系ah3中ADS基因表達與對照比較，沒有顯著性差異（圖7），這有可能是轉(zhuǎn)基因沉默引起的[17]。事實上ah3提供了一個很好的證據(jù)表明，即使是只有HDR基因表達量提高，也能夠?qū)е虑噍锼睾铣傻脑黾?。ADS基因表達量提高，有利于將MEP途徑提供的前體更多的環(huán)化成為青蒿素的倍半萜骨架紫穗槐二烯，從而使得由ADS催化的限速反應(yīng)被打破，導(dǎo)致更多代謝產(chǎn)物向青蒿素合成方向流動，從而增強青蒿素生物合成[18]。
討論
青蒿素具有獨特的藥用功效，但在青蒿中含量卻很低，不同品種的青蒿中青蒿素含量差異很大，為滿足市場對青蒿素的需求，已研究出多種提高青蒿素含量的方法。一是通過傳統(tǒng)的栽培方法提高青蒿素的含量；二是通過植物激素提高青蒿素的含量；三是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高青蒿素的含量。1996年，Vergauwe等[19]首次建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的青蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高青蒿素含量顯示出非常廣闊的前景[20]。青蒿素的代謝途徑現(xiàn)已研究的比較清楚，途徑上關(guān)鍵酶基因都已經(jīng)得到鑒定，使得利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育青蒿素高含量轉(zhuǎn)基因青蒿成為可能。
青蒿素的生物合成途徑屬于典型的植物類異戊二烯代謝途徑。其上游合成途徑有兩條，包括來自細胞質(zhì)中的MVA途徑和來自質(zhì)體中的MEP途徑。二者共同提供類異戊二烯化合物合成的基本單元IPP和DMAPP。其下游合成途徑主要是FPP的環(huán)化和紫穗槐二烯的一系列官能化直至形成終產(chǎn)物青蒿素。青蒿素生物合成上游途徑和下游途徑都涉及到一系列的酶促反應(yīng)步驟，有的反應(yīng)步驟對整條代謝途徑起到?jīng)Q定性作用，是整條途徑代謝流向目標方向的瓶頸，催化限速反應(yīng)的酶就是限速酶。代謝途徑中限速步驟的突破往往能夠增強代謝流往目標產(chǎn)物方向流動，因而限速步驟也就成為了代謝工程中最重要的遺傳改良靶點[21]。打破特定代謝途徑上目標代謝產(chǎn)物生物合成的限速步驟，經(jīng)典的方法是針對特定代謝途徑上的限速步驟，在存在該代謝途徑的植物中過量表達單個或多個限速酶基因，使這些限速酶始終維持較高的表達水平，從而達到打破瓶頸、推動代謝流往目標產(chǎn)物方向流動的目的。過表達限速酶在青蒿素合成途徑代謝工程中也得到了很好應(yīng)用[22]。在青蒿中過表達長春花（Catharanthus roseus L.）的HMGR基因能夠使青蒿素的含量提高22.5%[23]；在青蒿中同時過表達CYP71AV1和CPR基因使青蒿素含量提高38%[13]。在青蒿中同時轉(zhuǎn)入FPS、CYP71AV1和CPR這3個基因能夠使青蒿素含量提高3.6倍[24]。本研究中6個轉(zhuǎn)基因青蒿株系中青蒿素含量與非轉(zhuǎn)基因株系青蒿素含量相比都有不同程度的提高。說明HDR和ADS雙基因共轉(zhuǎn)化方法在一定程度上打破青蒿素生物合成途徑中這兩個限速反應(yīng)步驟，推動代謝流更多的向青蒿素合成方向流動，提高了青蒿素的合成能力，最終表現(xiàn)為青蒿素含量提高。
摘編自《藥學(xué)學(xué)報》2014年第9期：1346～1352頁，圖、表、參考文獻已省略。
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