路健，馮玉杰，陳宗凱，張炳遠

膽管癌起源于膽管上皮細胞，是一種破壞力極強的惡性腫瘤，它具有低診斷率和高病死率的特點[1]。發(fā)病隱匿、缺乏理想早期診斷標(biāo)記物、對常規(guī)放化療缺乏敏感性，這些都是造成膽管癌患者預(yù)后極差的癥結(jié)所在。手術(shù)是目前唯一有效的根治方法。近年來研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)浸潤是膽管癌一種常見的生物學(xué)特性，且與術(shù)后復(fù)發(fā)率和預(yù)后密切相關(guān)[2]。毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[3]。本試驗主要通過Western blotting檢測膽管癌細胞中M3受體的表達，并以CCK-8與流式細胞術(shù)觀察其激動劑及抑制劑對膽管癌細胞增殖凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源

膽管癌RBE細胞系（上海細胞庫）。

1.2 主要試劑、耗材及藥物的配制

毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3人多克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司），RPIM1640培養(yǎng)基（Hyclone，美國），胎牛血清（Hyclone，美國），Cell Counting Kit-8（CCK-8）（Beyotime，中國），匹羅卡品粉劑（SIGMA），硫酸阿托品（武漢昌恒生物醫(yī)藥制品研究所）。匹羅卡品先配成30 mmol/L的濃度，濾器過濾除菌，純1640培養(yǎng)液稀釋使用。硫酸阿托品使用時也用純1640培養(yǎng)液稀釋使用。

1.3 細胞株的培養(yǎng)及傳代

取對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰蛋白酶消化后備用。每天倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，定期拍照記錄。

1.4 Western blotting檢測RBE細胞中M3受體蛋白的表達

用不同濃度匹羅卡品及硫酸阿托品處理細胞72 h后，用PBS洗3～4次；細胞裂解液冰上裂解30 min。超聲粉碎，13000 r/min離心10 min留含全蛋白的上清液，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取各處理組等量蛋白樣品進行不連續(xù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h；加入單抗，孵育12 h，洗膜；加入合適濃度HRP二抗，孵育2 h，用增強化學(xué)發(fā)光劑（ECL）化學(xué)發(fā)光法檢測，于Mias圖象分析系統(tǒng)中分析，蛋白含量以Volume值表示（Volume：OD×mm2）。

1.5 CCK-8法檢測M3受體激動劑及阻滯劑對RBE細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期細胞，以每孔5000個細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔體積100μL，置于37 ℃、5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，待細胞貼壁后，PBS液洗2次去除未貼壁細胞，然后加入不同濃度的匹羅卡品（每孔終濃度為1 mmol/L，0.5 mmol/L，0.1 mmol/L）及硫酸阿托品（每孔終濃度為0.1 mmol/L，0.01 mmol/L），匹羅卡品加硫酸阿托品組，每組重復(fù)5孔，陰性對照組不加藥，分別于加藥24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-8溶液10μL。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h，在450 nm測定吸光度。

1.6 流式細胞術(shù)分析M3受體激動劑及阻滯劑對RBE細胞凋亡的影響

取對數(shù)生長期的RBE細胞，以不同濃度匹羅卡品及硫酸阿托品進行處理，對照組以未加藥干預(yù)的正常RBE細胞。培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，收集細胞，用冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，制成單細胞懸液, 使其濃度為1×106/ml。取100μL細胞懸液，加入5μL Annexin V-FITC和10μL碘化丙錠（PI）溶液，混勻后室溫避光孵育15 min；再加入400μL PBS。采用流式細胞儀（BD公司，F(xiàn)ACSCaliber）CellQuest軟件進行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RBE細胞中毒蕈堿型受體M3蛋白的表達情況

對照組、匹羅卡品組及匹羅卡品加阿托品組均出現(xiàn)M3受體蛋白條帶（圖1），以M3與GADPH的灰度比值來表示M3受體蛋白的相對表達數(shù)值（表1）。單用匹羅卡品組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=61.86，P＜0.05）。匹羅卡品+硫酸阿托品組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=54.51，P＜0.05）。正常對照組與阿托品組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.45，P＞0.05）。

圖1M3受體激動劑及阻滯劑對膽管癌細胞系RBE中毒蕈堿型受體M3蛋白表達的影響

表1 不同濃度匹羅卡品及阿托品對M3蛋白表達的影響

2.2 毒蕈堿型受體M3對RBE細胞增殖作用的影響

匹羅卡品對膽管癌細胞的增殖具有抑制作用，且其抑制作用呈濃度依賴。1 mmol/L匹羅卡品組及0.5 mmol/L匹羅卡品組與陰性對照組相比抑制作用明顯（P＜0.05），而0.1 mmol/L匹羅卡品組與陰性對照組相比抑制作用不明顯（P＞0.05）。且隨抑制作用呈時間依賴性，隨作用時間延長抑制作用逐漸減弱（1 mmol/L匹羅卡品組及0.5 mmol/L匹羅卡品組抑制作用在24 h、48 h、72 h時，呈減弱趨勢（P＜0.05），而0.1 mmol/L匹羅卡品組隨時間延長，抑制作用無差別（P＞0.05）阿托品+匹羅卡品組的吸光值明顯高于相應(yīng)匹羅卡品組的吸光值，即阿托品可以阻滯匹羅卡品對膽管癌細胞增殖的抑制作用。而阿托品組的吸光值與陰性對照組幾乎無差別（P＞0.05），即阿托品本身對膽管癌的增殖無抑制作用。

2.3 毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3對RBE細胞凋亡的影響

匹羅卡品組G1期細胞數(shù)與對照組相比，差別有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并且凋亡率也明顯升高（P＜0.05）。匹羅卡品與阿托品共同作用于細胞后，G1期細胞數(shù)所占比例及凋亡率的升高明顯受抑制。阿托品單獨作用于細胞后，G1期細胞數(shù)所占比例及凋亡率與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）。（表3）。

表2 不同濃度的匹羅卡品及阿托品對膽管癌細胞增殖的影響

表3 毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3對膽管癌細胞系RBE細胞周期及凋亡的影響

圖2 毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3對膽管癌細胞系RBE細胞凋亡的影響

3 討論

目前，許多研究致力于神經(jīng)遞質(zhì)與腫瘤之間的相互作用關(guān)系，特別是像膽管癌這種具有嗜神經(jīng)浸潤特性的腫瘤[4-6]。膽管系統(tǒng)是具有十分豐富自主神經(jīng)的器官，副交感神經(jīng)系統(tǒng)在腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[7-9]，其分泌的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）作用于效應(yīng)細胞的膽堿能受體（AchR），以調(diào)節(jié)效應(yīng)細胞的功能。已有研究表明，許多神經(jīng)遞質(zhì)受體在腫瘤中異常表達，神經(jīng)遞質(zhì)及其受體激動劑可以影響腫瘤細胞的增殖，分化及轉(zhuǎn)移過程[10]，而其受體拮抗劑可阻斷其作用。毒草堿型乙酰膽堿受體M3廣泛分布于平滑肌和腺體細胞，調(diào)節(jié)許多重要的生理活動，如神經(jīng)信號的傳遞、平滑肌收縮以及內(nèi)外分泌等功能。我們研究發(fā)現(xiàn)膽管癌細胞系RBE在M3受體激動劑匹羅卡品的作用下，其M3受體的表達呈濃度依賴性，隨匹羅卡品濃度的增加，蛋白的表達隨之增加，在1 mmol/L匹羅卡品作用下，表達最多，且這種作用可被M3受體阻滯劑阿托品所抑制，提示在膽管癌中，毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3在其受體激動劑及阻滯劑的作用下，可通過上調(diào)或下調(diào)其表達，來參與調(diào)節(jié)膽管癌的分化及轉(zhuǎn)移。

本組研究發(fā)現(xiàn)，匹羅卡品對膽管癌細胞的增殖具有抑制作用，且其抑制作用呈濃度依賴性，抑制作用隨時間的延長而逐漸減弱。我們推斷膽管癌中M3受體表達以及Ach的分泌，可能是機體對腫瘤發(fā)生所產(chǎn)生的一種細胞反應(yīng)及防御機制。石膽酰?；撬峒捌渌恍┠懼嶙鳛檎Ｈ梭w膽腸循環(huán)中的重要組成部分，是毒蕈堿樣乙酰膽堿受體M3的部分激動劑。我們猜想各種原因引起的膽汁淤積致使M3受體激動劑減少，成為影響膽管癌預(yù)后的重要因素，那么臨床上膽管癌患者早期使用PTCD引流的重要性由此可見。

許多種類的癌基因表達以后，即阻斷了腫瘤細胞的凋亡過程，使腫瘤細胞數(shù)目增加。毒蕈堿受體激活不僅對細胞的凋亡具有保護作用，還可以參與細胞凋亡的發(fā)生或誘導(dǎo)細胞的凋亡[11]。我們的研究顯示，1 mmol/L的匹羅卡品，作用于膽管癌細胞使膽管癌細胞中G1期的細胞數(shù)明顯增加，同時，膽管癌細胞凋亡率也明顯升高，表明匹羅卡品可通過M3受體作用于細胞，使細胞阻滯于G1期，進入S期、G2期的細胞減少，阻礙膽管癌細胞DNA的復(fù)制及膽管癌細胞的增殖，并且誘導(dǎo)膽管癌細胞的凋亡，其作用可被M3受體阻滯劑阿托品抑制。

膽管癌是耐藥性實體瘤，雖然近年研究采用局部或聯(lián)合化療治療膽管癌取得了一些進展，但真正有效的化療藥物和化療方案很少。我們可以推測膽管癌的生長可以被副交感神經(jīng)系統(tǒng)來調(diào)節(jié)，M3受體激動劑及阻滯劑對膽管癌增殖及凋亡的的影響，為膽管癌的藥物治療提供了新的思路。

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