張峰，詹銀楚，姜仁鴉，方劍，姜繼華

急性胰腺炎是胰腺最常見的病變，其發(fā)病率可達(dá)到百分之八，并呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。輕型急性胰腺炎是一種自限性疾病，預(yù)后較好，但有約25%的患者表現(xiàn)為重癥急性胰腺炎，病死率高達(dá)10%～30%[2-3]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)S100A12在許多疾病中，如心血管疾病[4-5]、炎癥性腸病[6]、急慢性肺部疾病[7]、阿爾茨海默病[8]、腎小球腎炎[9]、II型糖尿病[10]、風(fēng)濕性疾病[11]、川崎病[12]等中均發(fā)現(xiàn)S100A12呈特異性高表達(dá)狀態(tài)，并在炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)已有多項(xiàng)研究證明，S100A12不是管家蛋白，而是在不同細(xì)胞種類、細(xì)胞周期及狀態(tài)下選擇性表達(dá)的，與炎癥反應(yīng)有著十分緊密的聯(lián)系。

S100A12是S100蛋白家族中的成員之一[13]。S100A12基因定位于人類染色體1q21，介于S100A8和S100A9之間，其編碼的鈣結(jié)合蛋白S100A12以共價(jià)二聚體的形式存在。目前研究發(fā)現(xiàn)S100A12擁有兩個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)—C端和N端。這兩個(gè)位點(diǎn)也是S100A12區(qū)別于其他S100家族成員的重要依據(jù)[14]。當(dāng)S100A12在與Ca2+結(jié)合或受到其他炎癥介質(zhì)刺激而導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，目標(biāo)蛋白結(jié)合位點(diǎn)就會(huì)暴露，S100A12再通過(guò)結(jié)合相應(yīng)的配體，從而發(fā)揮其功能。因此，通過(guò)阻斷S100A12與其相應(yīng)的配體的結(jié)合，如使用S100A12重組抗體抑制S100A12功能，可能會(huì)為重癥急性胰腺炎的治療提供一種新的策略。本研究通過(guò)建立小鼠重癥急性胰腺炎模型，觀察、探討S100A12在小鼠重癥急性胰腺炎治療中的潛在作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)雌性ICR小鼠160只，體重（21.26±0.93）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。在適宜溫度、濕度和光照條件下于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心常規(guī)飼養(yǎng)一周，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。

1.2 主要試劑

雨蛙素（Caerulein，Cn）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購(gòu)于Sigma公司，小鼠S100A12重組抗體購(gòu)于Sino生物科技公司，小鼠S100A12酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)于Elabscience生物科技有限公司，小鼠AMY ELISA試劑盒購(gòu)于Cusabio生物科技有限公司，小鼠CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒均購(gòu)于上海西唐生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

脫水機(jī)（STP120，MICROM公司）、包埋機(jī)（AP280-2，MICROM公司）、切片機(jī)（HM335E，MICROM公司）、顯微鏡（Nikon eclipse 80i，Nikon公司）、電荷耦合元件（Charge-coupled Device，CCD）（DS-Fi1，500萬(wàn)象素，Nikon公司）、圖像分析軟件（Carl Zeiss Imaging Systems，Carl Zeiss公司）、低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（LDZ5-2，北京醫(yī)用離心機(jī)廠）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；孵育箱（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）、酶標(biāo)儀（WellscanMK-3，Labsystems Dragon公司）等由浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 模型建立

將160只SPF級(jí)雌性ICR小鼠用完全隨機(jī)方法分成對(duì)照組[A組，體重（21.17±1.02）g]、輕型組[B組，（21.28±0.92）g]、重癥組[C組，（21.22±0.91）g]和干預(yù)組[D組，（21.37±0.91）g]，每組40只。小鼠在建模開始前12 h禁食，但不禁水。雨蛙素、脂多糖在開始建模前臨時(shí)配制[15-16]，其中A組小鼠的生理鹽水按照25 mg/kg經(jīng)腹腔注射，連續(xù)7次，每次間隔1 h；B組小鼠的雨蛙素按照50μg/kg經(jīng)腹腔注射，連續(xù)7次，每次間隔1 h；C組小鼠的雨蛙素按照50μg/kg經(jīng)腹腔注射，連續(xù)7次，每次間隔1 h，脂多糖按照10 mg/kg在首次雨蛙素注射5 h后經(jīng)腹腔注射；D組則在首次雨蛙素注射前30 min按照50μg/kg注射S100A12重組抗體，余同C組。

1.5 采血化驗(yàn)

首次雨蛙素注射后8 h、12 h和24 h采血，采用眼眶取血法，接取適量置于2 mL EP管中，不抗凝，待血液凝集后，離心機(jī)3000 r/min離心5 min，收集上層血清，-20 ℃冰箱保存，待測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.6 取材觀察

高濃度戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉致死，剖腹，取出小鼠胰腺組織，10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木素和伊紅（HE）染色，光鏡觀察。胰腺病理學(xué)變化采用雙盲法按照Schmidt標(biāo)準(zhǔn)[17]對(duì)其進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 胰腺病理學(xué)評(píng)分

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用（±s）表示；多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)、Dunnett檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較采用SNK法；分值等級(jí)差異用Ridit分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生存率

A組、B組、D組無(wú)小鼠死亡，生存率均為100%；C組中有1只小鼠在實(shí)驗(yàn)開始后約30 h死亡，生存率97.5%。

2.2 血清指標(biāo)測(cè)定

與A組相比，各時(shí)段B組和C組血清AMY、CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α、S100A12（P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明建立模型成功；與B組相比，各時(shí)段D組血清S100A12濃度降低（P＜0.05），而與C組相比，各時(shí)段D組血清中AMY、CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明顯降低（P＜0.05），S100A12濃度顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明S100A12可能在監(jiān)測(cè)小鼠重癥急性胰腺炎發(fā)生、發(fā)展以及治療中起重要作用，見表2。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組血清指標(biāo)變化情況（±s）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組血清指標(biāo)變化情況（±s）

與A組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比，#P＜0.05；與C組比，△P＜0.05，△△P＜0.01

C組A組B組D組組別AMY（U/L）8h 12h 24h CRP（mg/L）8h 12h 24h IL-1β（pg/mL）8h 12h 24h IL-6（pg/mL）8h 12h 24h TNF-α（pg/mL）8h 12h 24h S100A12（pg/mL）8h 12h 24h 1161.2±364.01173.1±360.51160.9±342.93156.1±410.6*3592.7±489.1*2952.9±423.8*7353.2±485.1**8148.2±437.9**7119.2±470.8**2352.3±466.6△2724.1±420.8△2144.2±449.7△10.245±0.61410.183±0.66110.180±0.64915.820±0.680*17.862±0.761*13.926±0.759*21.440±0.865*25.261±0.982*19.285±0.969*14.594±0.710△13.648±0.712△12.680±0.716△10.611±1.89210.463±1.83610.516±1.821160.335±3.986**180.178±4.252**150.378±3.487**240.217±2.627*280.681±3.120*231.417±3.281*140.304±2.372△148.579±2.421△138.550±2.399△4.569±0.9974.581±1.0024.598±1.0049.491±1.236*21.707±1.313**16.747±1.432**50.863±1.351**59.914±1.146**55.367±1.240**41.869±1.428△36.775±1.456△31.499±1.377△66.764±4.45168.762±9.36866.353±8.539311.059±6.392**473.223±11.223**331.145±13.735**633.543±7.259**721.063±10.128**654.392±14.289**319.940±6.651△426.614±11.159△345.039±14.652△35.132±6.80034.966±6.49434.966±6.451343.714±7.610**591.451±20.609**464.947±19.527**1413.080±9.069**2393.831±33.564**1778.152±39.919**221.720±7.197**#△△166.902±11.298*#△△137.462±15.098*#△△

2.3 胰腺組織肉眼及光鏡觀察

肉眼見A組胰腺和胰外器官均基本正常；B組胰腺與周圍組織粘連，腺體腫脹，胞膜緊張，色澤蒼白，胰外器官無(wú)明顯異常變化；C組胰腺與周圍組織粘連嚴(yán)重，腺體腫脹，色澤灰暗，表面可見多處皂化斑點(diǎn)和出血點(diǎn)，大網(wǎng)膜、腸系膜等處出現(xiàn)少量皂化斑，肝臟色澤較暗，略顯腫脹；D組胰腺無(wú)明顯外觀異常，與周圍組織稍有粘連，胰外器官無(wú)明顯異常變化。光鏡下觀察A組胰腺間質(zhì)正常，小葉結(jié)構(gòu)完整，無(wú)出血、壞死改變（圖1A）；B組胰腺間質(zhì)充血水腫，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見少量局灶性腺泡壞死，輕微脂肪壞死，偶見出血（圖1B）；C組胰腺組織嚴(yán)重水腫，腺泡細(xì)胞分布相對(duì)獨(dú)立，猶如孤島，腺體細(xì)胞大量壞死，結(jié)構(gòu)模糊，局部呈融合性壞死，壞死區(qū)域有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1C）；D組胰腺輕微水腫，無(wú)空泡形成，有輕微脂肪細(xì)胞壞死，少見出血（圖1D）。

2.4 各組胰腺組織病理評(píng)分

圖1 光鏡下各組胰腺的病理變化，HE染色（圖A1、B1、C1、D1，×100；圖A2、B2、C2、D2，×400)

病理評(píng)分結(jié)果顯示：同A組相比，B組胰腺出現(xiàn)顯著的間質(zhì)水腫（P＜0.01）和輕中度的炎癥浸潤(rùn)（P＜0.05），但沒有出現(xiàn)明顯實(shí)質(zhì)壞死和出血（P＞0.05），C組胰腺出現(xiàn)嚴(yán)重的間質(zhì)水腫、炎癥浸潤(rùn)和實(shí)質(zhì)壞死，并出現(xiàn)不同程度的出血（P＜0.01），D組胰腺出現(xiàn)輕中度的間質(zhì)水腫和炎癥浸潤(rùn)（P＜0.05），但沒有出現(xiàn)明顯實(shí)質(zhì)壞死和出血（P＞0.05）；同B組相比，C組胰腺的炎性浸潤(rùn)、實(shí)質(zhì)壞死和出血要嚴(yán)重的多（P＜0.01），但D組胰腺的炎性浸潤(rùn)情況相較于B組要有所好轉(zhuǎn)（P＜0.05）；同C組相比，D組胰腺的炎性浸潤(rùn)、實(shí)質(zhì)壞死及實(shí)質(zhì)出血情況均要明顯好轉(zhuǎn)（P＜0.01），見表3。

3 討論

重癥急性胰腺炎患者住院時(shí)間延長(zhǎng)，治療費(fèi)用巨大，給人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)構(gòu)成巨大威脅。而目前用來(lái)判斷急性胰腺炎嚴(yán)重程度和預(yù)后的指標(biāo)有Ranson評(píng)分、Glasgow評(píng)分、APACHEII評(píng)分、胰酶、胰蛋白酶原激活肽（TAP）等[18]，但這些評(píng)估方法對(duì)重癥胰腺炎早期診斷的敏感性、特異性均達(dá)不到臨床要求，而且還存在檢測(cè)復(fù)雜、費(fèi)用高昂等局限性。有學(xué)者曾用垂盆草提取物來(lái)治療重癥急性胰腺炎及其引起的急性肺損傷取得良好效果，并通過(guò)病理發(fā)現(xiàn)治療后的動(dòng)物胰腺組織中腺泡細(xì)胞腫脹情況和腺泡細(xì)胞間炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯減輕[19]，但目前對(duì)垂盆草提取物的具體成分，特別是有效成分尚未完全弄清。因此，尋找新的、和急性胰腺炎嚴(yán)重密切相關(guān)并能夠在臨床推廣應(yīng)用的炎性因子并加以調(diào)控或許能使急性胰腺炎的治療產(chǎn)生突破性進(jìn)展。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)：輕型胰腺炎組的小鼠血清S100A12濃度就已經(jīng)開始升高，重癥急性胰腺炎小鼠的血清S100A12濃度更是明顯升高，通過(guò)干預(yù)抑制S100A12功能，小鼠胰腺的炎癥浸潤(rùn)、實(shí)質(zhì)壞死及實(shí)質(zhì)出血情況相較于重癥胰腺炎組的小鼠均要明顯好轉(zhuǎn)，甚至相比于輕型胰腺炎組，干預(yù)組中小鼠胰腺的炎性浸潤(rùn)情況也有所好轉(zhuǎn)。

表3 各組胰腺組織病理評(píng)分結(jié)果

S100A12主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞，除在血漿中，在腦脊液、唾液、滑膜液甚至是胃腸黏膜及糞便等中亦可發(fā)現(xiàn)。近來(lái)研究表明，S100A12在炎癥調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，Rouleau等所做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)：通過(guò)對(duì)小鼠靜脈注射S100A12，發(fā)現(xiàn)骨髓粒細(xì)胞向外周血遷移，進(jìn)而激活粒細(xì)胞并使之向炎癥區(qū)域趨化[20]。在急性胰腺炎的早期，中性粒細(xì)胞即被激活，釋放大量的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，是重癥急性胰腺炎引起全身炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[21]。

通過(guò)不同時(shí)段對(duì)各組中各項(xiàng)指標(biāo)的結(jié)果分析：由雨蛙素和脂多糖建立的重癥急性胰腺炎小鼠模型，其血清AMY、CRP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平相對(duì)于對(duì)照組都明顯升高，S100A12作為一種炎癥應(yīng)答的標(biāo)記物，其血清濃度也明顯上升，而通過(guò)事先注射S100A12重組抗體將會(huì)使這些炎癥因子水平明顯降低（見表2）。組織病理學(xué)觀察也證實(shí)了重癥急性胰腺炎的這種變化：胰腺損傷如間質(zhì)水腫，炎癥浸潤(rùn)，實(shí)質(zhì)壞死和出血都明顯加強(qiáng)，而通過(guò)注射S100A12重組抗體后，這些損傷變化又將會(huì)得到減輕（圖1，表3）。因此，我們認(rèn)為S100A12能夠作為重癥急性胰腺炎治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)，通過(guò)抑制S100A12的表達(dá)，進(jìn)而控制重癥急性胰腺炎時(shí)中性粒細(xì)胞的過(guò)度激活， 就可以通過(guò)減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放來(lái)減弱急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)，從而為治療重癥急性胰腺炎提供了一個(gè)新的策略。

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