胥孜杭 劉菲 鄒純樸 朱詩國 陳曉

[摘要] 目的 肺癌的發(fā)病率和病死率居高不下，而目前用于實驗研究的肺癌動物模型存在較大的局限性，故本研究認為建立一個穩(wěn)定、類似于人體腫瘤微環(huán)境的肺癌原位模型是深入研究肺癌的基礎。 方法 直接將穩(wěn)定表達蟲螢光素酶的鼠Lewis肺腺癌細胞與基質膠的混懸液注射于C57 BL/6小鼠左肺，無需打開胸腔只需將小鼠左胸部皮膚剪開約1 cm小口，定期利用小動物活體成像系統(tǒng)中的生物發(fā)光技術監(jiān)測小鼠腫瘤形成及轉移情況，并將小鼠處死后立即進行肺部組織活體取材，采用石蠟包埋、切片、HE染色做出病理學診斷。 結果 采用肺內注射的原位造模法成瘤率高，Lewis肺腺癌細胞數量只需0.5×105個即可成瘤，成功率達90%以上，且利用活體成像系統(tǒng)中的生物發(fā)光技術能監(jiān)測到模型小鼠腫瘤可轉移至對側胸廓、對側肺組織、雙側腋下及腹股溝淋巴結等。 結論 注射蟲螢光素酶穩(wěn)定表達的鼠Lewis肺腺癌細胞與基質膠混懸液構建的肺癌原位模型所需細胞數量少，成瘤率高，無手術死亡風險，轉移性好，監(jiān)測方便，操作簡單且可重復性高，為深入研究肺癌提供了良好模型。

[關鍵詞] 肺癌;原位模型;活體監(jiān)測

[中圖分類號] R734.2 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2015）01（a）-0015-04

Establishment of orthotopic lung cancer model in mice

XU Zihang ? LIU Fei ? ZOU Chunpu ? ZHU Shiguo ? CHEN Xiao

School of Basic Medical Science， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai ? 201203， China

[Abstract] Objective Morbidity and mortality remain high in lung cancer， but the animal lung cancer models used for the experimental research are limited， so to establish an orthotopic lung cancer model， which is stable and similar to the human tumor microenvironment， is a foundation for the further study of lung cancer research. Methods Luciferase-expressed LLC cells and matrigel matrix were directly injected into the left lung of C57BL/6 mice after cutting open a incision of the skin， which about 1 cm， and there was no need to open the chest. Small animal in vivo bioluminescence imaging system was used to monitor tumor growth and metastasis. At different time points， mice were sacrificed and the lung tissues were isolated and imbedded with paraffin. Pathological diagnosis was made by sliced and HE stained. Results LLC cells （0.5×105） were enough to form an orthotopic pulmonary tumor， and the success rate was above 90%. The metastases to contralateral thoracic， contralateral lung， bilateral axillary and inguinal lymph nodes were monitored by bioluminescence technique. Conclusion The orthotopic tumor models of lung cancer can successfully built by injection of luciferase-expressed LLC cells and matrigel matrix mixture. Furthermore， a few LLC cells are needed， and the tumor formation rate is high， besides there is no operation death risk. It has good metastases and high repeatability， in addition it's easy to operate and easy to be monitored， which provides a good method for the establishment of mouse models for further study of lung cancer.

[Key words] Lung cancer; Orthotopic model; Live monitoring

目前肺癌的發(fā)病率無論在國內還是國外都已位居各類腫瘤發(fā)病率的前列，在國內還呈現逐年上升的趨勢，其中約80%的肺癌都屬于非小細胞肺癌[1-3]，這引起了無論是西醫(yī)還是中醫(yī)、臨床還是實驗室的廣泛重視。但想要更深入地研究肺癌，穩(wěn)定、逼真（類似于人體腫瘤微環(huán)境）的動物模型是所有研究的基礎。

目前，肺癌動物模型的構建方法有化學誘導法、轉基因法、異位移植法、原位移植法等。其中化學誘導模型耗時長，且誘導出來的腫瘤存在較大異質性[4]，故有使用局限。轉基因模型雖對肺癌早期的發(fā)病機制及干預性治療效果的研究有很大幫助，但是由于該模型存在造模時間難掌握、花費較高、數量上難以滿足實驗要求以及轉基因產物不一定符合要求等問題[5]，故亦存在普遍使用的局限性。在過去的幾十年中，異位移植法中的皮下移植是對肺癌進行實驗研究的首選方法[6]，由于其操作簡單方便，通常只需在背部、腋部、后肢接種即可，但如今采取此種方法構建的肺癌模型所得出的實驗數據常遭到學者們的質疑，認為其脫離了源組織的微環(huán)境，導致實驗結果與臨床治療效果差異較大[7]，此外，早在1989年外國學者Paget[8]的種子和土壤學說也證實了器官微環(huán)境會影響腫瘤細胞的表型表達，而皮下移植瘤模型轉移發(fā)生率較小，并且生存曲線的數據不準確。原位移植法包括支氣管內注射[9]、肺內注射[10-12]，以及外科植入新鮮腫瘤組織[13]。其中支氣管注射成瘤及瘤體大小、數目均不穩(wěn)定，故使用局限性較大。相關實驗證明，在肺癌原位移植模型中，瘤塊外科原位移植法比腫瘤細胞懸液原位注射法轉移率高，轉移的發(fā)生也具有與臨床相似的時間依賴性，但是由于其創(chuàng)傷大、手術病死率高、實驗動物生存時間短，不宜普遍推廣[13]。而本研究構建的肺癌原位模型是在以往的肺內注射法的基礎上繼續(xù)改良創(chuàng)新，以期構建出更為理想的小鼠肺癌原位模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 ?Lewis肺癌（lewis lung carcinoma，LLC），源于C57 BL/6小鼠，屬鼠源性的非小細胞肺癌細胞株，購于中科院。

1.1.2 細胞轉染所需材料 ?轉染試劑Lipofectamine 2000TM購于Invitrogen公司，潮霉素（Hygromycin B）購于Roche公司，RPM1-1640購于HYCLONE公司，OPTI-MEMI購于Invitrogen公司。

1.1.3 實驗動物 ?C57 BL/6小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司（SCXK（滬）2007-0005），雄性，5周齡，17只，體重18～22 g。所有小鼠在SPF級屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)[實驗室使用許可證編號：SYXK（滬）2009-0069]。飼養(yǎng)室相對濕度為（55±10）%，溫度為（22±2）℃，光照12 h明暗交替，小鼠所用飼料為上海仕林生物科技有限公司生產的輻照鼠料。

1.1.4 matrigel基質膠/基底膜 ?BD MatrigelTM matrix Basement Membrane（BD公司，產品編號：356234）標準型濃度，-20℃下冷凍保存，避免多次凍融。

1.1.5 活體成像儀器 ?Caliper精諾真生物發(fā)光/熒光活體分子成像系統(tǒng)（IVIS？誖 Lumina XR Imaging System）[鉑金埃爾默（Perkin Elmer），型號：Lumina XR]，成像圖片分析軟件：LuminaⅡliving image 4.3。

1.2 方法

1.2.1 構建表達熒光素酶的LLC穩(wěn)轉細胞系 ?本實驗所用質粒載體是EGFP-FFLuc-HyTk-pMG^pac，該載體同時表達綠色熒光蛋白（GFP）、蟲螢光素酶（luciferase）、潮霉素（hygromycin B）和自殺基因（Tk基因），是由本研究組通過材料轉移協(xié)約（material transfer agreement，MTA）從德州大學MD安德森癌癥中心獲得。用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPM1-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)LLC細胞。轉染前將細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，置于5%CO2，飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞達到70%～80%融合濃度時開始轉染。轉染24 h后加入600 μg/mL的潮霉素進行抗性克隆篩選，挑選GFP陽性克隆，然后用300 μg/mL的潮霉素進行維持。

1.2.2 動物模型的建立 ?①配制細胞混懸液：將含有表達蟲螢光素酶的LLC細胞（0.5×105個）50 μL的細胞懸液與50 μL的matrigel基質膠等體積混勻，將其抽吸入事先預冷好的胰島素注射器。②麻醉固定：使用濃度為1%、劑量為5 mg/kg的戊巴比妥鈉將小鼠麻醉固定。③剃毛：用剃毛器將小鼠左胸部及腋下的黑毛剃除干凈，以充分暴露左側胸壁。④剪開皮膚：于小鼠左腋前線下1 cm處用左手持鑷子將皮膚拎起，右手持眼科手術剪將皮膚橫向剪開約1 cm的小口。⑤定位：觀察小鼠心臟搏動處，將心臟定位好后再水平向左移動皮膚切口，可發(fā)現與心臟暗紅色組織不同的白色實質性的左肺組織。⑥進針：定位好后將事先抽吸好的胰島素注射器插入左肺，進針深度3 mm，角度以垂直為佳，注射完后停頓5～10 s，再在傷口上滴灑含慶大霉素的生理鹽水少許。⑦縫合：切口縫合1～2針。⑧傷口護理：最后在傷口上涂抹紅霉素眼膏，幫助傷口愈合，造模完成。

1.2.3 小動物活體成像操作方法 ?小鼠于造模后進行活體成像，首先給予小鼠腹腔注射蟲螢光素酶底物，濃度為15 mg/mL，劑量為150 μL/只，底物作用時間5 min，5 min后予以異氟烷吸入麻醉5 min，然后再放入主機箱內，曝光10 s后進行圖像拍攝。構建原位模型，于小鼠左肺注射等比例的LLC-蟲熒光素本酶細胞（0.5×105個）與matrigel基質膠混懸液共100 μL。同一只小鼠按上述方法造模后分別于術后的第4、11、18天進行活體成像。

2 結果

2.1 穩(wěn)定表達蟲螢光素酶的LLC細胞系構建完成

由于EGFP-FFLuc-HyTk-pMG^pac載體在同一啟動子下表達EGFP（增強型綠色熒光蛋白）和蟲熒光素本酶，因此，EGFP的表達代表了蟲熒光素本酶的表達。如圖1（封三）所示，LLC細胞在轉染EGFP-FFLuc-HyTk-pMG^pac質粒DNA后，穩(wěn)定表達EGFP，表示穩(wěn)定表達蟲熒光素本酶的LLC細胞系構建成功，可以用于進一步研究。

2.2 小動物活體成像結果

將模型小鼠于造模后的第4天按照上述操作方法進行第1次活體成像，結果如圖2（封三），共造模17只小鼠，除第8號小鼠出現腹腔種植轉移外，其他16只小鼠均在胸部出現明顯熒光素酶信號，表示在胸部有腫瘤形成，其造模成功率為94%。

2.3 病理學檢測

小鼠活體成像結果說明在小鼠胸部有腫瘤形成，進行病理檢查進一步明確腫瘤在肺組織內而非在胸腔內。按照常規(guī)病理切片流程，取材：將10只小鼠于術后第4天活體成像后處死并立即進行活體取材，取出肺組織，此時肉眼觀察肺組織尚未見明顯的病變表現;接著使用10%中性福爾馬林溶液肺部灌流、固定;二甲苯透明、浸石蠟、包埋、切片、HE染色：二甲苯脫蠟2次，各10 min，無水乙醇漂洗二甲苯2次，各1 min;95%酒精1次，1 min，90%酒精1次，1 min，85%酒精1次，1 min，自來水沖洗2 min;蘇木精染色4 min，自來水沖洗1 min;1%鹽酸酒精分化20 s，自來水沖洗1 min，伊紅染色1 min，自來水洗30 s;梯度酒精脫水：70%酒精1次，20 s，90%酒精1次，20 s，95%酒精2次，各1 min，無水乙醇2次，各2 min;二甲苯透明2次，各3 min;中性樹膠封片。顯微鏡下鑒定小鼠左肺腫瘤病灶，有熒光信號的左肺經病理學檢測后證實為腫瘤組織（圖3，封三）。

2.4 模型小鼠大體解剖結果

于小鼠術后第18天進行第3次活體成像，成像后給予小鼠脫頸處死并對其進行解剖，觀察模型小鼠腫瘤生長及轉移情況，如圖4（封三），可見有熒光信號的左側肺部也正是解剖后左肺背部（進針部位）有明顯深紅色或白色腫瘤組織的地方，質地較硬，貫穿于整個左肺，在右肺、對側胸腔還可見散在的白色腫瘤組織。

2.5 模型小鼠腫瘤形成及轉移情況的監(jiān)測

模型小鼠于術后第4天進行第1次活體成像，于第11天進行第2次活體成像，于第18天進行第3次活體成像，以監(jiān)測小鼠腫瘤形成及轉移情況。3次活體成像的條件，如底物濃度、底物作用時間、麻醉時間、曝光時間、標尺等均為一致，成像結果如圖5（封三），可見模型小鼠在沒有藥物干預的情況下，腫瘤細胞的熒光信號強度顯現出時間依賴性（隨著時間增加而增強、增多），從第4天左肺較弱的藍色信號，至第18天整個胸廓出現紅色的強信號，說明本研究采用的蟲螢光素酶標記的LLC細胞所進行的生物發(fā)光法確實可以較好地監(jiān)測小鼠體內腫瘤形成及轉移情況。

3 討論

3.1 原位模型構建四大關鍵點

第一，盡可能保證每只小鼠所注射的細胞數量的均一性。手術時所用的matrigel基質膠是為了讓腫瘤細胞固定在局部，成為其生長的支架，有助于形成單一病灶，但matrigel基質膠具有遇高溫凝固的不可逆性，所以據筆者經驗，須事先將細胞懸液與matrigel基質膠在超凈臺中等比例充分混勻后抽吸入胰島素注射器內（注意：凡與matrigel基質膠接觸的用品均需預冷），以確保每只小鼠注射的細胞數量的一致性，抽吸完畢后立即將注射器插入事先準備好的冰盒中。第二，在手術過程中最為關鍵的就是定位，手術切口在左腋前線下1 cm處，切口為橫向切口，首先找到心臟搏動處，其顏色為隨心臟起伏的暗紅色組織，與心臟平行的左側就可看見與搏動的暗紅色組織形成對比的白色實質性的左肺，此時方可進針。第三，如圖2所示，8號小鼠于造模后第4天進行第1次活體成像時熒光信號布滿了整個腹腔，說明注射器可能刺進了心臟，導致細胞與matrigel基質膠的混懸液直接參與了血液循環(huán)，所以強調進針的深度以3 mm為佳（小鼠肺葉厚度在3 mm左右）。第四，左肺進針注射完畢后，不要急于出針，需停頓5～10 s，以防混懸液滲漏被注射器帶出。

3.2 肺癌原位模型的構建對中醫(yī)藥抗腫瘤的意義

首先，從中醫(yī)藏象理論出發(fā)，肺癌異位移植與原位移植在病位、病理變化上有很大的差別。有研究顯示，兩種不同的移植方式在腫瘤的形成過程中對缺氧的反應也表現出截然不同的結果[14]。而肺癌原位移植不僅可以制造出局部的腫瘤病變，而且還可以模擬肺臟受損后肺功能失常的一系列生理、病理變化，故原位移植模型更符合臨床實際。其次，從中藥作用的機制出發(fā)，不同的中藥對各個臟腑經絡有各自的指向作用，即所謂的“歸經”，如治療肺癌的常用化痰藥物：天南星、半夏、魚腥草、貝母、射干等，他們的“歸經”都是肺臟，即這些藥物在對肺臟其本身的病變有更好的治療效果。有研究發(fā)現，有些中藥對原位移植的肺癌模型小鼠有效但對皮下移植的模型小鼠效果差甚至無效，反之，有些中藥可能對皮下移植的腫瘤效果好，而對原位腫瘤效果不佳，從而產生藥物治療效果的假陽性[15]。可見，采用異位移植模型得到的實驗結果與臨床應用的實際效果之間存在較大差距，而原位模型的建立可以很好地解決以上存在的問題。原位移植法不僅可提高腫瘤成瘤率，突顯腫瘤的侵襲和轉移特性，還可觀察腫瘤血管的生成情況，從更大程度上模擬了人體肺部腫瘤的微環(huán)境[16]，同時也提升了模型實驗數據的可信度，故成為了研究關注的焦點。所以，肺癌原位模型的建立對于中醫(yī)藥抗肺癌無論是從理論角度還是從科研的角度來說都是至關重要的。

綜上所述，本研究所構建的小鼠肺癌原位模型，因其只需剪開皮膚，不流血，創(chuàng)傷小，無手術死亡現象，且所需細胞數量少，成瘤率高，轉移性好，操作簡單，可重復性強，大幅度地提升了肺癌原位模型的成功率，同時還可利用小動物活體成像系統(tǒng)中的生物發(fā)光技術監(jiān)測小鼠腫瘤形成及轉移情況，為深入研究肺癌奠定了基礎，也為中醫(yī)藥抗肺癌踏入國際舞臺奠定了基礎。

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（收稿日期：2014-09-01 ?本文編輯：任 ?念）