張 輝 俞誠波 張蓓蓓 葉美華 蔡敏秋 許紅苗 林敏麗
溫州醫(yī)學院附屬溫嶺醫(yī)院口腔科,浙江溫州 317500
白色念珠菌(Canidia albicans)是一種常見的條件 致病菌[1-2],正常情況下白色念珠菌不引起疾病,與機體共生,機體發(fā)生白色念珠菌感染的主要原因是正常的防御功能受到損害。白色念珠菌普遍存在于人體中,調(diào)查顯示[3],口腔中白色念珠菌帶菌率最高,約為85%。近年來大量廣譜抗生素以及免疫抑制劑的使用導致菌群失調(diào)和機體免疫力降低,使得非致病性白色念珠菌轉(zhuǎn)化為條件致病菌而引起各組織感染。研究顯示[4],口腔白色念珠菌感染屬于慢性感染,難以徹底根治,且病情容易反復發(fā)作,給患者的日常生活造成嚴重影響。關于白色念珠菌的致病機制目前仍無明確結論,有報道稱[5],黏附作用在白色念珠菌定植、侵襲中發(fā)揮著重要作用??谇火つど掀そ琴|(zhì)細胞是口腔防御的主要物質(zhì)基礎,也是白色念珠菌侵襲的主要靶細胞,但是白色念珠菌是如何侵襲口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞并產(chǎn)生致病作用,目前仍未見相關報道。本研究通過分析白色念珠菌對口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞的黏附作用以及對增殖和凋亡的影響,以期為豐富臨床治療提供理論基礎,現(xiàn)將研究成果報道如下:
白色念珠菌標準菌株(ATCC90029)購自南京便診生物科技有限公司,人口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞購自中國醫(yī)學科學院;沙堡(4%)葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)購自廣州市齊云生物技術有限公司;其他相關儀器和試劑均由溫州醫(yī)學院附屬溫嶺醫(yī)院實驗室提供。
1.2.1 白色念珠菌培養(yǎng) 將ATCC90029白色念珠菌標準菌株培養(yǎng)于沙堡培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)種3次后配成菌懸液,濃度設定為3×105CFU/mL。孢子型白色念珠菌:將白色念珠菌接種于酵母膏胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至長出白色乳狀菌落,將菌落再轉(zhuǎn)種于含YPD培養(yǎng)基的離心管中,37℃孵育18 h。菌絲型白色念珠菌:將白色念珠菌接種于pH 6.0、含10%磷酸鹽緩沖液(PBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中,37℃孵育3~5 h即誘導出菌絲型白色念珠菌。
1.2.2 口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞培養(yǎng) 常規(guī)細胞傳代培養(yǎng),選擇對數(shù)生長期的角質(zhì)細胞,用含0.02%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的胰蛋白酶(0.25%)消化,將細胞收集并離心,棄去上清液,加入預先配置的凍存液,將細胞吹打混勻。-80℃保存待用。
1.2.3 實驗分組 口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)48 h,將細胞貼壁制成單層細胞,棄去培養(yǎng)液后用PBS沖洗3次。將加入菌絲型白色念珠菌的作為菌絲組,加入孢子型白色念珠菌的作為孢子組,單獨培養(yǎng)的口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞作為陰性對照組。
1.2.4 黏附試驗 生長期口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞用胰蛋白酶消化,將孢子型、菌絲型白色念珠菌分別與口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞共同培養(yǎng)48 h,用濾膜收集口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞,再用PBS洗濾3次,收集懸液離心,并制成涂片;待風干后進行染色,電鏡下觀測黏附現(xiàn)象。隨機選擇100個口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞,統(tǒng)計白色念珠菌總數(shù),并計算黏附指數(shù)。黏附指數(shù)=黏附白色念珠菌數(shù)量/細胞總數(shù)。所有實驗平行測量3次,取3次均值。
1.2.5 細胞凋亡檢測 生長期口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞用胰蛋白酶消化,將不同表型白色念珠菌加入培養(yǎng)瓶中感染,并于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,然后胰蛋白酶消化,再用PBS沖洗3次,離心棄上清液。加入10 μL異硫氰酸熒光素混勻,室溫避光反應20 min;再加入5 μL碘化丙啶后,采用流式細胞儀上機檢測,計算細胞凋亡率,并用軟件分析G0/G1期、S期、G2/M期細胞百分數(shù)。上述操作平行重復3次,取均值。增殖指數(shù)(PI)=[(S+G2/M)/G0/G1+S+G2/M]×100%。
采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
菌絲組黏附指數(shù)顯著高于孢子組 (P<0.05);菌絲組凋亡率顯著高于孢子組和陰性對照組(P<0.05),而孢子組和陰性對照組凋亡率相比差異無統(tǒng)計學意義(P > 0.05)。 見表 1。
表1 各組黏附指數(shù)與凋亡率比較(±s)
表1 各組黏附指數(shù)與凋亡率比較(±s)
注:與孢子組比較,aP<0.05;與陰性對照組比較,bP<0.05;“-”表示無數(shù)據(jù)
組別 黏附指數(shù) 凋亡率(%)菌絲組孢子組陰性對照組7.63±1.39a 3.47±1.04-3.49±0.47ab 2.07±0.15 1.98±0.07
菌絲組G0/G1期細胞比例顯著低于孢子組和陰性對照組(P<0.05),S期、G2/M期細胞比例上升,且顯著高于孢子組和陰性對照組(P<0.05),PI明顯高于孢子組和陰性對照組(P<0.05),孢子組和陰性對照組PI比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。
表2 各組口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞周期及增殖指數(shù)比較(%,±s)
表2 各組口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞周期及增殖指數(shù)比較(%,±s)
注:與孢子組比較,aP<0.05;與陰性對照組比較,bP<0.05
組別增殖指數(shù)細胞周期G0/G1期 S期 G2/M期菌絲組孢子組陰性對照組38.17±7.83ab 49.47±11.41 57.71±9.39 8.54±4.03ab 6.47±2.73 5.35±2.11 20.18±9.59ab 10.71±3.19 12.38±4.35 42.79±18.73ab 28.67±8.79 26.87±7.64
口腔念珠菌感染是真菌-念珠菌屬感染所引起的口腔黏膜疾病[6],又稱口腔念珠菌病。近年來,由于抗生素和免疫抑制劑在臨床上的廣泛應用,發(fā)生菌群失調(diào)或免疫力降低,使內(nèi)臟、皮膚、黏膜被真菌感染者日益增多,口腔黏膜念珠菌病的發(fā)生率也相應增高[7-8],其中,白色念珠菌是最主要的病原菌。鵝口瘡(雪口?。┦亲畛R姷目谇荒钪榫 ?5%~50%的健康人口腔、陰道、消化道可帶有念珠菌,但不發(fā)?。欢侵虏⌒阅钪榫?,在某種條件下,可轉(zhuǎn)化為致病性[9],故有人稱念珠狀菌為條件致病菌。在幼兒雪口病、托牙性口炎、口角炎、念珠菌性白斑病和慢性黏膜皮膚念珠菌病患者中,白色念珠菌的檢出率分別為84%、69%、77%、84%和100%[10]。念珠菌毒性的強弱,取決于毒性物質(zhì)的代謝產(chǎn)物。在消化道或陰道內(nèi)寄生的酵母型念珠菌并無致病性,而當它發(fā)育為菌絲型時,才有致病性。白色念珠菌的毒素具有相當于病毒的磷脂酶-A型的活性[11],以本菌的混懸液注入動物靜脈中可致死。因此,病原菌的毒性和類型,與疾病力有密切關系。在健康帶菌者中,唾液含菌量低于200 CFU/mL,因此,一般鏡檢法不能直接查見涂片中的病原體。白色念珠菌對口腔黏膜上皮有較強的黏附性,這是它致病作用的“立足點”,此種黏附性依靠上皮細胞表面的甘露糖苷蛋白部分[12],作為細胞的表面受體而發(fā)揮其黏附作用。因此,可破壞糖苷蛋白或相似結構物抑制黏附的發(fā)生,這對探索新的治療藥物提供了方向。
角質(zhì)細胞是上皮細胞的重要組成部分,它為機體抵御外界病原菌侵襲提供了一層機械性屏障。目前研究證實[13],角質(zhì)細胞是口腔黏膜損傷的靶細胞。Obokata等[14]研究中也提到,角質(zhì)細胞是口腔黏膜上皮中含量最多的一種細胞,當發(fā)生白色念珠菌感染時,其也是主要侵襲靶細胞。白色念珠菌廣泛存在于人和動物中,正常條件下不會致病;但有多數(shù)研究顯示,白色念珠菌具有潛在致病性。Martinez等[15]證實,白色念珠菌感染疾病中,病變區(qū)上皮細胞明顯增厚,深層顯著增生,導致細胞有絲分裂加速,常伴有錯角化,因此推測白色念珠菌可以導致口腔黏膜出現(xiàn)白斑損害。但是白色念珠菌的具體作用機制目前還不清楚,有研究認為[16],白色念珠菌致病性主要體現(xiàn)在侵襲能力,目前已知與侵襲能力相關的因素包括黏附性、疏水性和表型轉(zhuǎn)換等。黏附性是白色念珠菌侵襲的第一步,也是其強致病力的主要標志。江文俊等[17]研究發(fā)現(xiàn),白色念珠菌主要存在芽生孢子和假菌絲兩種形式,也即孢子型和菌絲型,但是究竟何種類型的菌株具有致病性尚無統(tǒng)一定論。在本研究中,菌絲組黏附指數(shù)顯著高于孢子組,這與陽雋等[18]報道結論相同,說明菌絲型的黏附能力大于孢子型。也有學者發(fā)現(xiàn)[19],白色念珠菌菌絲形成進一步促進黏附作用,而黏附也會加速菌絲形成。因此,可以初步推測,白色念珠菌菌絲的形成有利于提高黏附性。
細胞凋亡是清除細胞的正常途徑,若正常凋亡受到影響,將會促進細胞異常發(fā)育和腫瘤的產(chǎn)生。李燕等[20]研究顯示,隨著腫瘤生長的加速,細胞凋亡數(shù)量也隨之增加。曹婕等[21]對口腔黏膜上皮脫落碎片進行檢測后證實,口腔惡性腫瘤或癌前病變的唾液中存在明顯細胞凋亡情況,其凋亡與口腔白斑密切相關。高巖等[22]也發(fā)現(xiàn),白斑癌變中,細胞凋亡參與了整個過程,且在不同過程作用各異,隨著上皮細胞增生的加重,凋亡呈指數(shù)上升。本次研究中菌絲組凋亡率顯著高于孢子組和陰性對照組,證實菌絲的產(chǎn)生促進細胞凋亡,這可能是白斑發(fā)生癌變的原因之一。
在細胞周期中,G1期是RNA和DNA聚合酶合成期,S期是DNA合成期。一般情況下,繁殖旺盛的細胞在S期、G2/M期比例較高。而PI則代表整個群體中細胞增殖的能力。為了進一步研究此過程,本研究對細胞不同分裂時期的細胞比例進行分析,結果顯示,菌絲組G0/G1期細胞比例顯著低于孢子組和陰性對照組,S期、G2/M期細胞比例顯著高于孢子組和陰性對照組,PI也隨之增加。說明菌絲型能夠促進口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞的增長,其機制可能是促進細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變,導致DNA合成加快,細胞增殖速度增加。此外本結果也提示白色念珠菌對口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞的增殖促進作用依賴于菌株的毒性作用和細胞的感染能力。目前多數(shù)專家達成的共識是:白色念珠菌中的毒性作用導致口腔黏膜上皮角質(zhì)細胞中抑制增殖物質(zhì)合成減少,使上皮細胞過度角質(zhì)化,細胞出現(xiàn)異常增生,并可能發(fā)生癌變。本研究結論與上述觀點完全相符。當然白色念珠菌導致口腔癌變的機制較多,而本研究也只是初步探討了其癌變可能的機制之一,但是本實驗證實白色念珠菌的表型與口腔白斑和癌變密切相關,這需要引起臨床重視。
綜上所述,白色念珠菌能夠?qū)е驴谇火つど掀そ琴|(zhì)細胞發(fā)生凋亡和增殖周期改變,這種改變依賴于該菌的黏附性和感染性。
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