張憲亮+徐波+陸樂+何標+余鋒+季瀏

摘 要：為了解自主跑輪運動對C57BL/6小鼠空間學習記憶能力及海馬內Notch信號通路的影響，選用12只雄性5周齡C57BL/6小鼠，隨機分為運動組（R組，n=6只）和對照組（C組，n=6只），運動組進行8周的自主跑輪運動，對照組安靜飼養(yǎng)，第8周開始利用Morris水迷宮測試其學習記憶能力。運動結束后，斷頸處死小鼠取雙側海馬，用Western Blot檢測小鼠大腦海馬內NICD的蛋白表達水平，用RT-PCR檢測小鼠大腦海馬內的Jagged-1、Notch-1、PS-1、Hes-1的mRNA表達水平。結果顯示：Morris水迷宮實驗顯示，運動組小鼠學習記憶能力明顯強于對照組;Western Blot測試，運動組小鼠海馬內NICD表達顯著上調，RT-PCR測試，運動組小鼠海馬內Jagged-1 mRNA、Notch-1 mRNA、PS-1 mRNA和Hes-1 mRNA表達水平較對照組顯著上調。結果說明，8周自主跑輪運動激活Notch信號通路，提高了海馬空間學習記憶能力。

關 鍵 詞：運動生物化學;學習記憶;Notch信號通路;自主跑輪運動;小鼠

中圖分類號：G804.7 文獻標志碼：A 文章編號：1006-7116（2014）06-0134-05

Effects of voluntary wheel exercise on spatial learning and memory and

Notch signal pathway of mice

ZHANG Xian-liang1，XU Bo1，LU Le2，HE Biao1，YU Feng1，JI Liu1

（1.Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention Ministry of Education，

School of Physical Education and Health，East China Normal University，Shanghai 200241，China;

2.School of Physical Education，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract： In order to understand the effects of voluntary wheel exercise on spatial learning and memory and Notch signal pathway in hippocampus of C57BL/6 mice， the authors prepared 12 5-week old male C57BL/6 mice， randomly divided them into an exercise group （group R， n=6） and a control group （group C， n=6）， let the mice in group R do a voluntary wheel exercise for 8 weeks， let the mice in group C live in a calm condition， starting from week 8， tested their learning and memory ability by utilizing Morris water maze， after the exercise was finished， cut the neck of the mice and took out hippocampus at both sides， measured the protein expression level of NICD in hippocampus of the mice by means of Western blot， measured the mRNA expression levels of Jagged-1， Notch-1， PS-1 and Hes-1 in hippocampus in the brains of the mice by means of RT-PCR， and revealed the following findings： the Morris water maze experiment showed that the learning and memory ability of the mice in group R was significantly stronger than that of the mice in group C; in Western blot test， the expression of NICD in hippocampus of the mice in group R increased significantly; in RT-PCR test， the mRNA expression levels of Jagged-1， Notch-1， PS-1 and Hes-1 in hippocampus of the mice in group R increased significantly as compared with those of the mice in group C. The said findings indicated that 8-week voluntary wheel exercise activated Notch signal pathway， enhanced the spatial learning and memory ability of hippocampus.endprint

Key words： sports biochemistry;learning and memory;Notch signal pathway;voluntary wheel exercise;mouse

運動作為中樞神經系統(tǒng)一種有效的刺激形式，在大腦結構和功能可塑性的調節(jié)中起重要作用，大量研究發(fā)現適宜的運動可以提高大腦學習記憶能力，但其機制是多方面的，也是不確切的。近來有研究發(fā)現，Notch信號通路在學習記憶能力的調節(jié)中起了關鍵作用[1]。Notch信號通路是一條傳遞細胞與細胞間信號的信號轉導途徑，在進化上高度保守，它精確調控著神經系統(tǒng)的發(fā)育分化及凋亡，并與突觸可塑性、海馬學習記憶能力等腦的高級功能密切相關。Ge等[2]發(fā)現敲除果蠅內的Notch基因導致其長期記憶能力下降，而過表達Notch基因野生型果蠅內可增強其長期記憶能力，提示Notch信號通路在果蠅的長期記憶能力中起了關鍵作用。Costa等[3]選用Notch+/-轉基因鼠和野生型鼠進行實驗，發(fā)現Notch+/-轉基因鼠空間學習能力下降，而其他學習能力沒有改變，同時選用RBP-J+/-轉基因鼠和野生型鼠進行實驗，發(fā)現RBP-J基因缺失同樣造成了空間學習記憶能力的下降，說明，Notch信號通路在海馬空間學習記憶能力的調節(jié)中起重要作用。而且Zhang等[4]發(fā)現Notch信號通路可能通過促進海馬神經發(fā)生，提高突觸可塑性，從而改善海馬學習記憶能力。但是，運動對小鼠海馬空間記憶能力的提高是否通過激活Notch信號通路呢？本實驗通過8周的自主跑輪運動干預，研究運動對5周齡C57BL/6雄性小鼠海馬Notch信號通路中Jagged-1、Notch-1、PS-1、Hes-1表達的影響，并探討其在運動改善學習記憶能力中的作用。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物及分組

5周齡健康雄性C57BL/6小鼠12只（由上海斯萊克公司提供），每籠1只，常規(guī)分籠飼養(yǎng)，隨機分為跑輪運動組（R組）和對照組（C組），每組6只。環(huán)境室溫：（22±5） ℃;動物飼養(yǎng)環(huán)境濕度：40%～60%;光照：自然晝夜交替。自由飲食、飲水。

1.2 運動方案

對照組放于不含跑輪的飼養(yǎng)籠內，安靜飼養(yǎng);跑輪運動組放于含有跑輪的飼養(yǎng)籠內，進行為期8周的跑輪運動，運動量的記錄每天1次。第8周開始，兩組小鼠均進行Morris水迷宮測試，上午10：00開始，為期 6 d，1～5 d為定位航行實驗，第6天為空間探索實驗。

1.3 取材

8周訓練結束后，將小鼠斷頸處死，取雙側海馬組織，放入-80 ℃冰箱保存，待測PCR及Western blot指標。

1.4 Western blot檢測海馬內NICD蛋白表達水平

按每20 mg組織加入100～200 μL的Western裂解液（含PMSF）中混勻，對稱置于瓷珠勻漿儀中勻漿后，置于冰上靜置10 min，重復2～4次。于4 ℃下，12 000 g離心3～5 min，取上清，分裝，置于-80 ℃冰箱待測。根據BCA蛋白濃度測定試劑盒步驟，測定蛋白含量。計算蛋白上樣量，使用SDS-PAGE電泳將蛋白轉至PVDF膜上。經2 h封閉后，分別加入一抗（NICD，1︰500，c-23307，santa），4 ℃下孵育過夜。次日加入二抗（HRP，IgG，1︰1 000，碧云天），室溫孵育2 h。TBST搖床洗10 min，重復3次后，于暗室使用ECL發(fā)光顯影，Alpha凝膠成像系統(tǒng)自動曝光，捕捉圖像，ImageJ1.46對圖像進行灰度值分析，將NICD蛋白與內參蛋白的平均密度之比作為NICD的相對表達水平。

1.5 RT-PCR檢測BDNF、Jagged-1、Notch-1、PS-1、Hes-1的mRNA

取適量的海馬組織，用Trizol法提取小鼠海馬內總的RNA，逆轉錄得到穩(wěn)定的cDNA，實時熒光定量PCR檢測Jagged-1、Notch-1、PS-1、Hes-1mRNA的相對表達量，引物序列見表1。

1.6 統(tǒng)計分析

運用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析計算，數據處理使用T檢驗，P<0.05具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。所有數據均用均數±標準差來表示。

2 實驗結果及分析

運動組小鼠平均每天運動量為（7 418.47±

2 432.15） m。

2.1 對小鼠Morris水迷宮測試的影響

1）定位航行實驗結果見圖1。

圖1 自主跑輪運動對小鼠Morris水迷宮實驗

定位航行實驗的影響

如圖1所示：5 d定位航行實驗中，兩組小鼠的潛伏期呈下降趨勢，運動組小鼠的潛伏期均低于對照組小鼠。其中，第2天和第3天運動組小鼠潛伏期顯著低于對照組小鼠（P<0.05）。而兩組小鼠的平臺象限路程百分比呈上升趨勢;而且運動組小鼠平臺象限路程百分比高于對照組，其中兩組小鼠第1天的平臺象限路程百分比出現了顯著性差異（P<0.05）。

2）空間探索實驗結果。

在空間探索實驗中，與對照組相比（（22.81±5.28）%），運動組小鼠平臺象限路程百分比（（30.78±7.78）%）出現了顯著性差異（P<0.05）。

2.2 對小鼠海馬內NICD蛋白表達的影響

如圖2所示，與對照組（0.21±0.11）相比，運動組小鼠海馬內NICD蛋白表達（0.75±0.36）顯著上調（P<0.05）。

圖2 自主跑輪運動對小鼠海馬內NICD蛋白表達的影響

2.3 對小鼠海馬內Notch信號通路相關基因mRNA的影響

如圖3所示，與對照組相比，運動組Jagged-1 mRNA（P<0.01）、Notch-1 mRNA（P<0.05）、PS-1 mRNA（P<0.05）和Hes-1 mRNA（P<0.01）的表達水平均出現明顯上調，其中，Jagged-1和Hes-1出現了非常顯著性。endprint

圖3 運動對小鼠Jagged-1、Notch-1、PS-1、

Hes-1 mRNA表達的影響

3 討論

Morris水迷宮是一種強迫實驗動物（一般指大鼠、小鼠）通過被動游泳的方式，學習尋找并記憶隱藏于水下平臺的實驗，用于大鼠或小鼠學習、記憶能力的檢測。包括定位航行實驗和空間探索實驗。經實驗發(fā)現，兩組小鼠潛伏期均呈現逐漸下降的趨勢、平臺象限路程百分比均呈上升趨勢，說明兩組小鼠均經歷一個學習的過程，逐漸記憶平臺象限的位置。并且在第2、3天運動組小鼠潛伏期顯著低于對照組小鼠，第1天運動組小鼠平臺象限路程百分比顯著高于對照組小鼠，說明運動組小鼠在定位航行實驗中的表現要好于對照組小鼠。在空間探索實驗中，運動組小鼠平臺象限路程百分比顯著高于對照小鼠，說明運動組小鼠記憶平臺象限的表現要好于對照組小鼠，運動組小鼠呈現出較好的記憶能力。運動組小鼠在迷宮實驗中更有目的性，學習記憶能力要好于對照組。提示，8周的自主跑輪運動提高了小鼠學習記憶能力。Uysal等[5]將22 d Wistar大鼠分為對照組和運動組，運動組進行8周的跑臺訓練，并對其進行Morris水迷宮測試，結果顯示運動組小鼠提高了空間記憶能力。褚昕宇等[6]將10周齡C57BL/6小鼠分為對照組、應激組、運動組和應激運動組。通過Morris水迷宮實驗檢測其學習記憶能力，發(fā)現運動不僅可以提高正常小鼠學習記憶能力，還可以抑制應激造成的小鼠學習記憶能力的損害。這些研究與本實驗的研究結果表現出高度的一致性，說明適宜的體育運動可以提高海馬空間學習記憶能力。其原因可能是：長期適宜運動后，血液循環(huán)加快，大腦海馬得到充足的養(yǎng)料及氧氣，促使腦細胞發(fā)育良好;而且適宜的體育運動促使機體體溫升高，增強了大腦海馬內相關抗氧化酶的活性[7]。

Notch信號轉導途徑參與了學習記憶的神經過程。研究發(fā)現在敲除Notch基因的果蠅內，其長時程記憶受到損害[8]。對Notch基因突變的小鼠進行水迷宮實驗，發(fā)現其空間記憶能力缺陷，并發(fā)現其突觸可塑性受到抑制，而給予Notch配體Jagged-1后，學習記憶能力得以改善，說明Notch通路與海馬學習記憶密切相關[9-10]。Notch信號通路主要由Notch受體、Notch配體、CSL轉錄因子以及靶分子等構成。Notch受體在神經干細胞上高度表達，某些誘導因子的作用下，干細胞上的Notch受體與鄰近細胞上的Notch配體相互結合，經過腫瘤壞死因子α轉化酶（tumor necrosis factor-α converting enzyme TACE）和γ-分泌酶（主要成分為PS-1）的酶切，產生NICD（notch intracellular domain，NICD）蛋白，并將有活性的NICD釋放入胞漿轉移到核內，與CSL蛋白結合，形成轉錄因子，激活Hes-1等靶基因，參與神經系統(tǒng)的發(fā)生，提高海馬學習記憶能力[11]。

本實驗發(fā)現，自主運動組小鼠NICD蛋白顯著上調，Jagged-1、Notch-1、PS-1以及Hes-1mRNA表達顯著增加。NICD是Notch信號通路激活的標記分子，Hes-1是NICD轉移至核內后激活的靶基因，因此NICD蛋白的高表達和Hes-1基因的高表達說明運動后Notch信號通路被激活。Moritz等[12]通過免疫組織化學方法發(fā)現運動后增加了神經細胞的數量，同時發(fā)現在新增殖的細胞內同時伴隨有NICD的陽性表達，說明運動激活了Notch信號通路，與本實驗結果一致。另外，本實驗同時發(fā)現運動組小鼠學習記憶能力顯著高于對照組，說明運動提高學習記憶能力的同時激活了Notch 信號通路，提示Notch信號通路可能介導了運動誘導的學習記憶能力提高。

NICD是Jagged-1與Notch-1結合后在TACE酶和γ-分泌酶酶切下形成的，因此Jagged-1與Notch-1的表達水平與NICD密切相關。Tsivitse等[13]在骨骼肌重塑實驗中發(fā)現，下坡跑上調了Notch-1與其配體的表達，激活Notch信號通路，介導了骨骼肌重塑。本實驗中運動組小鼠Jagged-1和Notch-1基因表達水平顯著高于對照組小鼠，說明運動組小鼠Notch信號通路中Jagged-1與Notch-1的結合更多，提示運動組小鼠NICD的表達上調可能與運動后Jagged-1和Notch-1的高表達有關，與Tsivitse等人研究一致。另有研究發(fā)現在敲除TrkB基因的小鼠內Jagged-1表達顯著低于對照組小鼠，說明BDNF可以通過與其受體TrkB結合，增加Jagged-1的表達，從而激活Notch信號通路[14]。同時大量實驗證實自主跑輪運動后海馬神經元內的BDNF mRNA和TrkB mRNA的表達明顯增加[15-16]。因此推測運動可能通過增加BDNF表達水平，提高Jagged-1表達，從而激活Notch信號通路。

于此同時，Notch受體與配體結合后，必須在S2、S3位點分別經過TACE與γ-分泌酶的酶切，才能形成NICD，從而調節(jié)Notch信號通路。PS-1是γ-分泌酶的主要成分，是Notch信號通路中的關鍵調節(jié)酶。Chen等[17]選用野生型鼠作為研究對象，測試其LTP，發(fā)現抑制γ-分泌酶的活性可導致其LTP下降，因此，γ-分泌酶在正常生理條件下可能起了一個積極的作用。本實驗同時檢測了PS-1的mRNA水平，發(fā)現運動組小鼠PS-1mRNA增加，說明運動激活Notch信號通路也可能與PS-1的表達上調有關。但是，關于γ-分泌酶研究主要集中于阿爾茨海默?。ˋD），它參與了AD的發(fā)病特征老年斑的核心物質Aβ的形成。研究發(fā)現抑制γ-分泌酶的活性，可以減少Aβ的形成，從而改善AD的學習記憶能力[18]。王芳[19]研究發(fā)現有氧跑臺訓練可以顯著降低-D半乳糖注射造模AD大鼠海馬內PS-1的基因表達，與本實驗的研究并不一致。原因可能是所選老鼠模型不同，PS-1在野生型鼠中參與了Notch信號通路的激活，促進了海馬神經發(fā)生，提高了突觸可塑性，促進海馬空間學習記憶能力;而PS-1在AD鼠內，主要介導了Aβ的形成，引起機體氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等，降低海馬空間學習記憶能力。因此關于運動對PS-1的影響仍不十分清楚，需進一步研究證實。endprint

參考文獻：

[1] Ables J L，Breunig J J，Eisch A J，et al. Notch just development：notch signalling in the adult brain[J]. Nat Rev Neurosci，2011，12（5）：269-283.

[2] Ge X，Hannan F，Xie Z，et al. Notch signaling in drosophila long-term memory formation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（27）：10172-10176.

[3] Costa R M，Honjo T，Silva A J. Learning and memory deficits in notch mutant mice[J]. Curr Biol，2003，13（15）：1348-1354.

[4] Zhang X，Huang G，Liu H，et al. Folic acid enhances notch signaling，hippocampal neurogenesis，and cognitive function in a rat model of cerebral ischemia[J]. Nutr Neurosci，2012，15（2）：55-61.

[5] Uysal N，Tugyan K，Kayatekin B M，et al. The effects of regular aerobic exercise in adolescent period on hippocampal neuron density，apoptosis and spatial memory [J]. Neurosci Lett，2005，383（3）：241-245.

[6] 褚昕宇，季瀏，王澤軍. 跑轉輪運動與限制性應激對成年小鼠海馬神經發(fā)生以及空間學習記憶能力的影響[J]. 北京體育大學學報，2013，36（5）：69-74.

[7] 徐波，黃濤，季瀏. 跑臺訓練增強大鼠的學習記憶及其海馬BDNF基因表達[J]. 北京體育大學學報，2011，34（4）：51-54.

[8] Lasky J L，Wu H. Notch signaling，brain development，and human disease[J]. Pediatr Res，2005，57（5 Pt 2）：104R-109R.

[9] Dahlhaus M，Hermans J M，Van Woerden L H，et al. Notch1 signaling in pyramidal neurons regulates synaptic connectivity and experience-dependent modifications of acuity in the visual cortex[J]. J Neurosci，2008，28（43）：10794-10802.

[10] F?rster E，Bock H H，Herz J，et al. Emerging topics in reelin function[J]. Eur J Neurosci，2010，31（9）：1511-1518.

[11] Ehm O，G?ritz C，Covic M，et al. RBPJkappa-dependent signaling is essential for long-term maintenance of neural stem cells in the adult hippocampus[J]. J Neurosci，2010，30（41）：13794-13807.

[12] Moritz D Brandt，Antonia Maass，Gerd Kempermann，et al. Physical exercise increases Notch activity，proliferation and cell cycle exit of type-3 progenitor cells in adult hippocampal neurogenesis[J]. European Journal of Neuroscience，2010，32（8）：1256-1264.

[13] Tsivitse S K，Peters M G，Stoy A L，et al. The effect of downhill running on Notch signaling in regenerating skeletal muscle[J]. Eur J Appl Physiol，2009，106（5）：759-767.

[14] Dorfman M D，Kerr B，Garcia-Rudaz C，et al. Neurotrophins acting via TrkB receptors activate the jagged1-Notch2 cell-cell communication pathway to facilitate early ovarian development[J]. Endocrinology，2011，152（12）：5005-5016.

[15] Vaynman S，Ying Z，Gomez pinilla F. Interplay between brain derived neurotrophic factor and signal transduction modulators in the regulation of the effects of exercise on Synaptic plasticity[J]. Neuroscienc，2003，122（3）：647-657.

[16] Berchtold N C，Kesslak J P，Cotman C W，et al. Hippocampal brain derived neurotrophic factor gene regulation by exercise and the medial septum[J]. Neurosci Res，2002，68（5）：511-521.

[17] Chen Y，Behnisch T. The role of γ-secretase in hippocampal synaptic transmission and activity-cdependent synaptic plasticity[J]. Neurosci Lett，2013，56（13）：300151-300156.

[18] Townsend M，Qu Y，Gray A，et al. Oral treatment with a gamma-secretase inhibitor improves long-term potentiation in a mouse model of Alzheimers disease[J]. J Pharmacol Exp Ther，2010，333（1）：110-119.

[19] 王芳. 有氧運動對AD大鼠學習記憶、Aβ相關基因表達及脂質過氧化的影響[D]. 上海：華東師范大學，2011：25.endprint