王莉莉 朱振龍 郝彤

1.華北石油管理局總醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北任丘062552；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科，河北石家莊050030；3.華北石油管理局總醫(yī)院病理科，河北任丘062552

Survivin在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)

王莉莉1朱振龍2▲郝彤3

1.華北石油管理局總醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北任丘062552；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科，河北石家莊050030；3.華北石油管理局總醫(yī)院病理科，河北任丘062552

目的研究Survivin在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜樣腺癌（EA）三種組織中表達(dá)的差異。方法選取華北石油管理局總醫(yī)院2010年1月～2012年6月手術(shù)切除子宮并經(jīng)病理證實(shí)的EA存檔標(biāo)本40例（EA組），經(jīng)診刮或?qū)m腔鏡檢查病理結(jié)果示子宮內(nèi)膜不典型增生20例（AHE組），同時(shí)選取同期因子宮脫垂或子宮肌瘤行子宮切除的正常子宮內(nèi)膜20例作為對(duì)照（CON組）。通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)三組中Survivin表達(dá)情況的差異。應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果EA組的Survivin表達(dá)陽(yáng)性率為90%，顯著高于CON組（75%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在EA組中，組織分級(jí)為G1、G2、G3級(jí)的患者Survivin陽(yáng)性率分別為85.0%、90.9%、100.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；手術(shù)-病理分期為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期的患者Survivin陽(yáng)性率分別為62.1%、85.7%、100.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；肌層浸潤(rùn)深度＜1/2及≥1/2的患者Survivin陽(yáng)性率分別為88.5%、92.9%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Survivin陽(yáng)性率為100.0%、80.6%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；存在脈管浸潤(rùn)及無(wú)脈管浸潤(rùn)的患者Survivin陽(yáng)性率分別為100.0%、84.2%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論相較于正常子宮內(nèi)膜，EA組織中Survivin表達(dá)顯著增多。Survivin的陽(yáng)性表達(dá)率與EA組織學(xué)分級(jí)和手術(shù)-病理分期相關(guān)，與肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及有無(wú)脈管浸潤(rùn)無(wú)關(guān)。

子宮內(nèi)膜樣腺癌；Survivin；免疫組織化學(xué)；組織分級(jí)；手術(shù)-病理分期

子宮內(nèi)膜樣腺癌（endometrioid adenocarcinoma，EA）是最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。在我國(guó)，EA的發(fā)病率高居?jì)D科惡性腫瘤的第2位［1］。迄今為止，有關(guān)EA的發(fā)病機(jī)制尚存在爭(zhēng)論。Survivin基因是凋亡抑制（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）基因家族的新成員，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂和抑制細(xì)胞凋亡的雙重作用［2］。在眾多腫瘤和胚胎組織中都有表達(dá)，但在成熟分化細(xì)胞中完全缺失。目前針對(duì)Survivin在EA中的研究正逐步開(kāi)展，已發(fā)現(xiàn)Survivin具有作為子宮內(nèi)膜癌診斷標(biāo)志物的潛力，有學(xué)者應(yīng)用免疫組織化學(xué)（streptavidin-peroxidase，SP）法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、Western-blot等方法對(duì)比了正常子宮內(nèi)膜組織、不典型增生內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中Survivin水平后，認(rèn)為在癌組織中，Survivin水平明顯高于正常組織和不典型增生組織，并且有可能成為治療子宮內(nèi)膜癌的靶點(diǎn)［3-4］。本研究應(yīng)用SP法檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生（atypical hyperplasia of endometrium，AHE）及EA中Survivin的表達(dá)，旨在探討其在EA發(fā)生、發(fā)展中的作用，為臨床診斷、治療EA提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取華北石油管理局總醫(yī)院2010年1月～2012年6月手術(shù)切除子宮并經(jīng)病理證實(shí)的EA存檔標(biāo)本40例作為EA組，年齡31～77歲，平均53.4歲。選取經(jīng)診刮或?qū)m腔鏡檢查病理結(jié)果示AHE樣本20例（AHE組）。同時(shí)選取同期因子宮脫垂或子宮肌瘤行子宮切除的正常子宮內(nèi)膜樣本20例作為對(duì)照組（CON組）。依據(jù)2009年修訂的國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）EA的手術(shù)-病理分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期7例，Ⅲ期4例；組織分級(jí)［G1（高分化）：非鱗狀或桑葚狀實(shí)性生長(zhǎng)類型為≤5%；G2（中分化）：非鱗狀或桑葚狀實(shí)性生長(zhǎng)類型為＞5%～50%；G3（低分化）：非鱗狀或桑葚狀實(shí)性生長(zhǎng)類型為＞50%］顯示，G120例，G211例，G39例；子宮內(nèi)膜浸潤(rùn)深度＜1/2 26例，子宮內(nèi)膜浸潤(rùn)深度≥1/2 14例；淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移36例，有轉(zhuǎn)移4例；淋巴脈管無(wú)浸潤(rùn)38例，浸潤(rùn)2例。所選標(biāo)本臨床病歷資料完整，術(shù)前均未行化療、放療或免疫治療等，同時(shí)排除合并有其他部位惡性腫瘤。所有標(biāo)本診斷均經(jīng)2名高年資病理醫(yī)師再次審核確認(rèn)。所選標(biāo)本蠟塊均做4μm連續(xù)切片6張，其中3張分別行常規(guī)HE染色和SP染色，其余3張備用。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色采用SP法，嚴(yán)格按照SP試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。具體步驟如下：將切片浸于二甲苯中5min 2次，100%、95%、90%、85%、75%乙醇中各5min 2次，自來(lái)水沖洗，PBS洗2次。1%甲醇雙氧水，室溫10min，蒸餾水沖洗3次，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min?？乖⒉嵝迯?fù)將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92～98℃并持續(xù)15 min。取出容器，室溫冷卻15 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5min。切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。用以防止抗原與非特異性抗體結(jié)合，甩去多余液體，不洗。切片上滴加第一抗體（兔抗人Survivin多克隆抗體的原液濃度為1mg/mL，稀釋度為1∶10，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），4℃過(guò)夜，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。切片上滴加生物素化的山羊抗兔第二抗體（稀釋度為1∶100，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），室溫下30min，0.1mol/L PBS洗3次×5min。切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫下30min，0.1mol/L PBS洗3次×5 min。使用DAB顯色試劑盒，1 mL蒸餾水按順序滴加顯色劑A、B、C各1滴，鏡下控制顯色時(shí)間。充分水洗。水洗后，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3 min，依次放入蒸餾水，70%、80%、90%、100%乙醇各20 min，二甲苯1 h時(shí)脫水，中性樹(shù)脂封片。最后選擇各組陽(yáng)性和陰性組織相進(jìn)行100×和200×顯微照相。

1.2.2 HE染色切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色3min，自來(lái)水沖洗；1%鹽酸乙醇分化3 s，自來(lái)水沖洗；氨水乙醇返藍(lán)5 s，自來(lái)水沖洗；伊紅染色5 s，自來(lái)水沖洗；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂膠封片。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定胞核中棕黃色顆粒染色深、均勻一致為陽(yáng)性，胞核中未見(jiàn)棕黃色顆粒為陰性。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇乳腺癌標(biāo)本做陽(yáng)性對(duì)照。每例隨機(jī)選出10個(gè)不重復(fù)、不重疊的高倍鏡視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及所有細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率=Σ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/ Σ總細(xì)胞數(shù)×100%。染色強(qiáng)度：基本不著色為0分，淺黃色為1分，橘黃色為2分，棕黃色為3分；著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率：≤5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%為3分。將每張切片染色程度與染色細(xì)胞百分率得分相加之和為其最后得分。標(biāo)本染色得分在0～6分之間，其中，0～2分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Survivin表達(dá)情況

在正常子宮內(nèi)膜組織Survivin不表達(dá)或僅有少部分腺體表達(dá)，且呈弱陽(yáng)性（圖1A），而Survivin在EA和AHE中的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性（圖1B、C）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：EA組的Survivin表達(dá)陽(yáng)性率為90%（36/40），AHE組的Survivin表達(dá)陽(yáng)性率為75%（15/20），CON組的Survivin表達(dá)陽(yáng)性率僅為20%（4/20）；其中，EA組及AHE組中Survivin表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EA組的Survivin表達(dá)陽(yáng)性率較AHE組有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 EA組臨床病理參數(shù)與Survivin表達(dá)的關(guān)系

2.2.1 EA組織分級(jí)與Su r v i v in表達(dá)的關(guān)系在EA組中，組織分級(jí)為G1級(jí)的患者Survivin陽(yáng)性率為85.0%（17/20），G2級(jí)Survivin陽(yáng)性率為90.9%（10/11），G3級(jí)Survivin陽(yáng)性率為100.0%（9/9）。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示，不同組織分級(jí)患者Survivin表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2.2 EA組手術(shù)-病理分期與Su r v i v i n表達(dá)的關(guān)系

在EA組中，手術(shù)-病理分期為Ⅰ期的患者Survivin陽(yáng)性率為62.1%（18/29），Ⅱ期Survivin陽(yáng)性率為85.7%（6/7），Ⅲ期Survivin陽(yáng)性率為100.0%（4/4）。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示，不同手術(shù)-病理分期分級(jí)患者Survivin表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2.3 EA的肌層浸潤(rùn)深度與Sur v ivin表達(dá)的關(guān)系

在EA組中，肌層浸潤(rùn)深度＜1/2的患者Survivin陽(yáng)性率為88.5%（23/26），肌層浸潤(rùn)深度≥1/2的患者Sur vivin陽(yáng)性率為92.9%（13/14）。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示，不同肌層浸潤(rùn)深度患者Survivin的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.4 EA的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與Sur v ivin表達(dá)的關(guān)系

在EA組中，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Survivin陽(yáng)性率為100.0%（4/4），無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Survivin陽(yáng)性率為80.6%（29/36）。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示，不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Survivin的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。2.2.5 EA的脈管浸潤(rùn)與Su r v i v in表達(dá)的關(guān)系在EA組中，存在脈管浸潤(rùn)的患者Survivin陽(yáng)性率為100.0%（2/2），無(wú)脈管浸潤(rùn)的患者Survivin陽(yáng)性率為84.2%（32/38）。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示，不同脈管浸潤(rùn)患者Survivin的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

1997年，Ambrosini等［2］率先在人類基因組庫(kù)中通過(guò)篩選、分離等手段，最終克隆出Survivin。Survivin基因是一種新型凋亡抑制基因，其定位于17號(hào)染色體的q25區(qū)，編碼產(chǎn)生Survivin蛋白。Survivin蛋白是抗凋亡作用最強(qiáng)但分子量最小的凋亡抑制蛋白（IAP），它在惡性腫瘤組織及胚胎中表達(dá)豐富，在子宮內(nèi)膜、胸腺、胎盤(pán)等組織也可有少量表達(dá)，但其在正常的分化成熟組織以及癌旁組織中則為低表達(dá)或無(wú)表達(dá)。Survivin基因的特異性表達(dá)的特點(diǎn)使其在腫瘤研究領(lǐng)域日益受到重視。

先后有報(bào)道證實(shí)，Survivin基因在肝癌、膽囊癌、膀胱癌、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌、鼻癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤組織中高表達(dá)，并與腫瘤的治療及預(yù)后相關(guān)［5-13］。Takai等［4］研究發(fā)現(xiàn)，Survivin基因在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)極低，但在EA組織中表達(dá)的陽(yáng)性率卻極高。本研究結(jié)果也顯示了相似的結(jié)果，即EA組和AHE組中Survivin的表達(dá)率分別為90%（36/40）和75%（15/20），均明顯高于正常子宮內(nèi)膜組［20%（4/20），P＜0.05］，提示Survivin基因在EA的發(fā)生中起著重要作用。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Survivin基因表達(dá)的強(qiáng)度與腫瘤的組織分級(jí)、臨床分期及組織浸潤(rùn)深度等呈正相關(guān)，Survivin基因表達(dá)增高往往預(yù)示治療困難及預(yù)后較差［9-10，12］。Stefansson等［14］研究認(rèn)為，Survivin基因表達(dá)的強(qiáng)度與EA的組織分級(jí)、臨床分期及肌層浸潤(rùn)深度呈正相關(guān)，且Survivin蛋白與EA惡性程度及臨床預(yù)后密切相關(guān)，其高表達(dá)提示EA患者的低生存率［4，14］。但對(duì)此一些學(xué)者則持相反觀點(diǎn)，認(rèn)為Survivin基因表達(dá)的強(qiáng)度與EA的組織分級(jí)、臨床分期及生存率不存在相關(guān)性［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，Survivin的表達(dá)強(qiáng)度與EA組織學(xué)分級(jí)和手術(shù)-病理分期存在一定相關(guān)性，與肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及有無(wú)脈管浸潤(rùn)無(wú)關(guān)。手術(shù)-病理分期Ⅲ期患者EA表達(dá)率明顯高于Ⅰ期患者，說(shuō)明腫瘤組織分化越差，分期越嚴(yán)重，組織中Survivin蛋白的表達(dá)水平就越高。因此，筆者推斷Survivin蛋白在腫瘤形成的各個(gè)階段都起了至關(guān)重要的作用，與Takai等［4］的報(bào)道相符。Eekanli等［15］研究表明，Survivin蛋白表達(dá)超過(guò)正常值即可以判定組織存在癌變可能，提示Survivin蛋白具有篩查診斷早期腫瘤的價(jià)值，是EA形成過(guò)程中的早期事件。本研究中20例正常子宮內(nèi)膜中有4例表達(dá)呈陽(yáng)性，這可能與子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖活躍有關(guān)，提示應(yīng)對(duì)該類患者進(jìn)行密切隨訪。

綜上所述，Survivin蛋白可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡程序，并能維持或促進(jìn)基因缺陷的細(xì)胞生存優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而導(dǎo)致基因的突變和細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，因此，Survivin在EA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

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Expression of Survivin in endometrial carcinoma

WANG Lili1ZHU Zhenlong2▲HAO Tong3
1.Department of Obstetrics and Gynecology,North-China Petroleum Administration Bureau General Hospital,Hebei Province,Renqiu 062552,China;2.Department of Pathology,the First Hospital,Hebei Medical University,Hebei Province,Shijiazhuang 050030,China;3.Department of Pathology,North-China Petroleum Administration Bureau General Hospital,Hebei Province,Renqiu 062552,China

ObjectiveTo compare the expression of Survivin in normal endometrium,atypical hyperplasia of endometrium and endometrioid adenocarcinoma.M ethodsForty cases of endometrioid adenocarcinoma samples resected from operation and confirmed by pathology were selected as EA group,20 cases of atypical hyperplasia of endometrium (AHE)confirmed by pathologic from endocervical curettage or hysteroscopy were selected as AHE group,20 cases of normal endometrium from hysterectomy for uterine prolapse or uterine fibroids were selected as control group(CON group)in North-China Petroleum Administration Bureau General Hospital from January 2010 to June 2012.Expression of Survivin in the three groups were detected by immunohistochemistry method.All the data was analyzed by SPSS 16.0.ResultsThe positive expression rate of Survivin in the EA group was 90%,which was higher than that in the CON group(75%),with statistically significant difference(P＜0.05).In EA group,the positive expression rates of Survivin in patientswith organization classification ofG1,G2,G3were 85.0%,90.9%and 100.0%,with statistically significant differences(P＜0.05);which in panties with surgery-pathological staging ofⅠ,Ⅱ,Ⅲwere 62.1%,85.7%and 100.0%,with statistically significant difference(P＜0.05);which in patientswithmuscularis invasion depth＜1/2 or≥1/2 were 88.5%and 92.9%,without statistically significant difference(P＞0.05);which in patients with lymphatic metastasis or non-metastasiswere 100.0%and 80.6%,without statistically significant difference(P＞0.05);which in patientswith vascular invasion or non-vscular invasion were 100.0%and 84.2%,without statistically significant difference(P＞0.05).ConclusionCompared with normal endometrium,endometrioid adenocarcinoma has higher Survivin expression.The positive expression rates of Survivin are correlated with the histological grade and surgery-pathological stage of EA,but has no relationship withmyometrial invasion,lymph nodemetastasis or vascular invasion.

Endometrial carcinoma;Survivin;Immunohistochemistry;Histological grade;Surgery-pathological stage

R737.33 [

]A [

]1673-7210（2015）01（a）-0019-04

2014-09-23本文編輯：程銘）