鞏子路，田童童，張 建，牛玉靜，劉 娟，李 甜

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

白斑狗魚(yú)魚(yú)肉中抗凍蛋白的分離純化

鞏子路，田童童，張 建*，牛玉靜，劉 娟，李 甜

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

利用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析法將從白斑狗魚(yú)魚(yú)肉組織中獲取的抗凍蛋白進(jìn)行分離純化。試驗(yàn)以魚(yú)肉抗凍蛋白的熱滯活性（THA）為響應(yīng)值，對(duì)提取溫度、pH值、提取時(shí)間、料液比4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：白斑狗魚(yú)魚(yú)肉中抗凍蛋白提取的最佳工藝條件為溫度5.14℃、pH值8.40、提取時(shí)間為1.88 h，料液比1∶2（g∶mL），此時(shí)熱滯活性達(dá)到0.061 2℃。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示熱滯活性（THA）為（0.059 4±0.001 3）℃，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱和Sephadex G-50分子篩層析柱純化后獲得了電泳純的抗凍蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量約為7.6 ku，熱滯活性大約為（0.052±0.001 5）℃。

白斑狗魚(yú)；抗凍蛋白；分離；純化

抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）是一類抑制冰晶生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，它能以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點(diǎn)而對(duì)其熔點(diǎn)影響甚微。從而導(dǎo)致水溶液的熔點(diǎn)（melting point，MP）和冰點(diǎn)（freezing point，F(xiàn)P）之間出現(xiàn)差值，這種差值稱為熱滯活性（thermalhysteresis activity，THA）。因而抗凍蛋白亦稱為熱滯蛋白或溫度遲滯蛋白（thermalhysteresis proteins，THPs）[1]。抗凍蛋白具有特殊的功能和熱滯性質(zhì)，能夠降低冰點(diǎn)、抑制冰晶的生長(zhǎng)和重結(jié)晶，修飾冰晶的形態(tài)[2]?？箖龅鞍讖V泛分布于魚(yú)類、昆蟲(chóng)、植物以及微生物[3-6]中，DAVIES P L等[7]于1990年首先報(bào)道了魚(yú)類AFP的生物化學(xué)特性和分子結(jié)構(gòu)。隨后的研究中，越來(lái)越多的AFP結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的5類AFP（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和AFGP）都具有THA。抗凍蛋白通過(guò)吸附到冰晶表面，由于Kelvin效應(yīng)使冰晶的生長(zhǎng)處于熱力學(xué)上不利的狀態(tài)，從而抑制冰晶的生長(zhǎng)，保護(hù)避免結(jié)冰或者對(duì)結(jié)冰敏感的生命有機(jī)體免受結(jié)冰引起的傷害。由于抗凍蛋白具有阻止冰晶生長(zhǎng)而不破壞細(xì)胞的特點(diǎn)，因而有望在食品原料的冷處理、冷凍食品的保鮮等方面發(fā)揮重大作用[8-11]。

本實(shí)驗(yàn)以生存于新疆北部額爾齊斯河流域的白斑狗魚(yú)為研究對(duì)象，以魚(yú)肉作為實(shí)驗(yàn)原材料，通過(guò)傳統(tǒng)的分離方法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取抗凍蛋白的工藝參數(shù)，并且通過(guò)陰離子交換柱層析及凝膠柱層析對(duì)抗凍蛋白進(jìn)行純化，以期為今后抗凍蛋白的發(fā)展與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白斑狗魚(yú)：購(gòu)買于石河子市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、考馬斯亮藍(lán)R-250、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和四甲基乙二胺（tetramethylethylene-diamine，TEMED）：美國(guó)Sigma公司。三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、維生素C（vitamin C，VC）：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DEAE-Sepharose和Sephacryl S-500：美國(guó)GE-Healthcare Bio-Sciences AB公司；PVDF膜：美國(guó)Millipore公司；Mini-proteinⅢ：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將從市場(chǎng)上購(gòu)買的活體白斑狗魚(yú)麻醉，再將其魚(yú)肉組織從魚(yú)體剝離，立即用液氮冷凍，置于組織搗碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，之后置于-70℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。稱取一定量處理好的魚(yú)肉樣品與等體積的Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）充分混合，于4℃冷藏箱中靜置過(guò)夜。然后于5 000 r/min、4℃的條件下離心分離10 min，棄去沉淀，取上清液，并且將其進(jìn)行冷凍干燥，所得干燥樣品即為白斑狗魚(yú)魚(yú)肉抗凍蛋白粗品。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）作為提取液，將處理好的樣品分別按照試驗(yàn)預(yù)設(shè)的不同料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）、不同pH值5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，不同浸提溫度-4℃、0℃、4℃、8℃、12℃和不同提取時(shí)間0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h等條件探討分析各個(gè)單因素對(duì)魚(yú)肉抗凍蛋白提取效果的影響。

1.3.3 提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)可能影響魚(yú)肉抗凍蛋白提取的4個(gè)因素[13]（料液比、pH值、提取溫度和提取時(shí)間）進(jìn)行詳細(xì)的單因素試驗(yàn)分析。為了得到魚(yú)肉抗凍蛋白提取的最優(yōu)工藝參數(shù)，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以熱滯活性（THA）（Y）為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）對(duì)魚(yú)肉抗凍蛋白的提取進(jìn)一步的優(yōu)化[12]。響應(yīng)面分析因素與水平編碼如表1所示。

1.3.4 魚(yú)肉抗凍蛋白的純化

將所得到的魚(yú)肉抗凍粗蛋白按照一定比例溶解于Tris-HCl（50 mmol/LTris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC，pH 7.5）緩沖液中，通過(guò)針孔濾膜（0.45μm）過(guò)濾后置于透析袋中過(guò)夜透析，期間更換透析液3～4次，然后將透析液進(jìn)行超濾濃縮至一定濃度，通過(guò)陰離子柱進(jìn)行層析分離，用4倍體積Tris-HCl（pH 7.5）洗脫，再用含0～0.8 mol/L NaCl的600 mL Tris-HCl進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，5 mL/管分管收集。紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)調(diào)節(jié)至280 nm。通過(guò)弱陰離子交換柱層析后具有活性的收集液用3 ku超濾膜進(jìn)行超濾濃縮到5 mL，以待進(jìn)一步純化。

1.3.5 SDS-PAGE電泳

十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）參照CHALKLEY RJ等[15]報(bào)道的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。樣品與樣品緩沖液按照1∶1（v/v）的比例混合，沸水浴5 min，上樣量10μL，分離膠和濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.0%和5%。樣品分別在80 V和120 V恒壓的條件下在凝膠中遷移，濃縮膠中遷移30 min后進(jìn)入分離膠直到指示劑距離凝膠板邊緣1 cm左右處停止電泳，整個(gè)電泳試驗(yàn)大概為3 h。從凝膠板取下電泳膠片，將其置于染色缸中于搖床上染色40 min，染色結(jié)束后于脫色液中脫色24 h，期間更換染色液4～5次。樣品分子質(zhì)量的確定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker的相對(duì)遷移率計(jì)算獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對(duì)魚(yú)肉抗凍蛋白熱滯活性的影響

利用緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC，pH 7.5）作為提取液，按照不同比例與凍干的白斑狗魚(yú)魚(yú)肉樣品混合，其他條件保持在一個(gè)水平，探討不同料液比對(duì)魚(yú)肉抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，白斑狗魚(yú)魚(yú)肉抗凍蛋白的熱滯活性隨著料液比的增加而上升，且在料液比為1∶4（g∶mL）時(shí)達(dá)到最高，其THA為（0.048 0±0.001 3）℃。繼續(xù)增加料液比的比例，魚(yú)肉中的抗凍蛋白的熱滯活性呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榭箖龅鞍谉釡钚缘母叩团c抗凍蛋白的含量有一定的相關(guān)性，起初隨著料液比增加，蛋白質(zhì)也隨著不斷的溶出，含量隨之而升高，因此熱滯活性也越來(lái)越大，然而料液比過(guò)高，原料中總蛋白質(zhì)含量是一定的，因此，抗凍蛋白含量會(huì)相對(duì)較低，故其熱滯活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此確定最佳料液比為1∶4（g∶mL）。

2.1.2 pH值對(duì)魚(yú)肉抗凍蛋白熱滯活性的影響

利用不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）的緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）作為提取液，按照料液比1∶4（g∶mL）與凍干的魚(yú)肉樣品混合，其他條件保持在一個(gè)水平，探討不同pH值對(duì)魚(yú)肉抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著pH值的不斷上升，魚(yú)肉中抗凍蛋白的熱滯活性呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為8.0時(shí)，魚(yú)肉抗凍蛋白的熱滯活性達(dá)到最高，其THA值為（0.052 0± 0.002 4）℃。繼續(xù)升高pH值，抗凍活性呈現(xiàn)出較緩慢的下降趨勢(shì)。這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在酸性溶液中溶解度低，堿性溶液中溶解度高而造成的。隨著pH值增加，蛋白質(zhì)溶解度在不斷的增加，所以蛋白濃度逐漸升高，抗凍蛋白熱滯活性也隨之升高，然而，當(dāng)pH值為9.0時(shí)，其熱滯活性略微呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樵趬A性較強(qiáng)的環(huán)境下破壞了抗凍蛋白的空間結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致其熱滯活性下降。因此確定最佳提取pH值為8.0。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)魚(yú)肉抗凍蛋白熱滯活性的影響

利用pH 8.0的緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）作為提取液，按照料液比1∶4（g∶mL）與凍干的魚(yú)肉混合，其他條件保持在一個(gè)水平，探討不同的提取時(shí)間對(duì)魚(yú)肉抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，魚(yú)肉中抗凍蛋白的熱滯活性也在不斷的升高，當(dāng)時(shí)間達(dá)到2.0 h，魚(yú)肉抗凍蛋白熱滯活性達(dá)到最高，其THA值為（0.055 0±0.001 8）℃。繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，魚(yú)肉抗凍蛋白的熱滯活性基本保持不變，而THA值呈現(xiàn)出略微下降趨勢(shì)。這可能與蛋白質(zhì)在浸提液中的溶出速率有關(guān)，在2.0 h之前，魚(yú)肉抗凍蛋白沒(méi)有完全的溶解于浸提液中，因此隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出熱滯活性增加，而2.0 h之后，魚(yú)肉的抗凍蛋白基本溶解完全，達(dá)到了最大濃度，所以熱滯活性基本保持不變。因此確定2.0 h為最佳提取時(shí)間。

2.1.4 不同溫度對(duì)魚(yú)肉抗凍蛋白熱滯活性的影響

利用pH 8.0的緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）作為提取液，按照料液比1∶4（g∶mL）與凍干的魚(yú)肉混合，提取時(shí)間設(shè)定為2.0 h，探討不同提取溫度對(duì)魚(yú)肉抗凍蛋白熱滯活性的影響，其結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著溫度的不斷升高，魚(yú)肉抗凍蛋白的熱滯活性也在不斷的上升，當(dāng)溫度升高至4℃時(shí)，熱滯活性達(dá)到最高（0.065 0±0.002 4）℃。這可能是因?yàn)樵擊~(yú)本身生活的特殊地理環(huán)境有關(guān)，盡管其生活在氣候條件較寒冷的湖泊海域中，但是溫度過(guò)低對(duì)其抗凍蛋白熱滯活性也具有一定程度的影響。蛋白質(zhì)在較高的溫度下，其排列緊密的空間結(jié)構(gòu)會(huì)變得松散，有利于蛋白質(zhì)的溶出，從而會(huì)使其抗凍蛋白的含量不斷增加，因此熱滯活性也隨之升高。然而抗凍蛋白的特殊屬性使其在溫度過(guò)高時(shí)會(huì)很大程度影響其原有的固有屬性，其熱滯活性呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。因此確定4℃為最佳提取溫度。

2.2 響應(yīng)面分析法結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了得到更優(yōu)的分離提取抗凍蛋白的工藝參數(shù)，利用Design-Expert8.0軟件中的中心組合設(shè)計(jì)（center composite design，CCD）原理對(duì)4個(gè)單因素進(jìn)一步優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，方差分析結(jié)果如表3所示。

當(dāng)P＜0.05時(shí)，影響因素對(duì)響應(yīng)值影響為差異顯著，當(dāng)P＜0.001 0時(shí)為差異高度顯著，P＜0.000 1時(shí)為差異極顯著。表3中顯示模型的P=0.0002＜0.05，說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂酗@著性，失擬項(xiàng)的P=0.076 7＞0.05，不顯著，表明響應(yīng)面設(shè)計(jì)的模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好。由表3可知，X2的P=0.001 5＜0.05，表明pH值起著顯著性的影響；X1的P=0.058＞0.05，說(shuō)明影響不顯著，說(shuō)明溫度的影響次于pH值。各個(gè)因素經(jīng)過(guò)回歸擬合后，經(jīng)解得到的抗凍蛋白熱滯活性的回歸方程為：

通過(guò)軟件求解方程，得出最優(yōu)工藝條件為溫度5.14℃、pH 8.40、提取時(shí)間為1.88 h，液料比1∶2（g∶mL），在此條件下，抗凍蛋白熱滯活性達(dá)到0.061 2℃。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃裕M(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示熱滯活性為（0.059 4±0.001 3）℃，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。

通過(guò)回歸優(yōu)化得出響應(yīng)曲面及等高線[14]如圖5所示。

等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小。圖形為網(wǎng)形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。由圖5A可知，隨著pH值和溫度不斷增加，熱滯活性也在逐漸升高。由圖5B可以明顯看出，溫度對(duì)魚(yú)肉中的抗凍蛋白的熱滯活性具有較顯著的影響。圖5C可以明顯看出，溫度和料液比均顯示出二次影響。隨著溫度和料液比不斷升高，熱滯活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。由圖5D可知，曲面的坡度比較陡，說(shuō)明二者之間的交互作用對(duì)抗凍蛋白的熱滯活性的影響顯著，該結(jié)果在表1方差分析中也得到驗(yàn)證。圖5E可以看出，pH值和料液比對(duì)熱滯活性都表現(xiàn)出二次效應(yīng)，隨著pH值和料液比的增加，熱滯活性也在不斷的上升，說(shuō)明pH值和料液比交互作用對(duì)熱滯活性的影響是顯著的。圖5F結(jié)果表明時(shí)間和料液比對(duì)抗凍蛋白的熱滯活性均表現(xiàn)出二次效應(yīng)。

2.3 白斑狗魚(yú)魚(yú)肉抗凍蛋白的分離純化

白斑狗魚(yú)魚(yú)肉中抗凍蛋白樣品經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱和Sephadex G-50分子篩柱洗脫圖譜分別如圖6所示，魚(yú)肉抗凍蛋白的電泳圖譜如圖7所示。

由圖6A可知，魚(yú)肉抗凍蛋白樣品經(jīng)過(guò)DEAE-Sepharose陰離子交換層析后得到一個(gè)較為明顯的吸收峰，經(jīng)電泳檢測(cè)后顯示該峰下的蛋白質(zhì)為雜質(zhì)蛋白，如圖7A所示。將蛋白含量較高的收集管合并，超濾濃縮至5 mL，然后經(jīng)過(guò)Sephadex G-50分子篩柱進(jìn)行層析純化。由圖6B可知，凝膠層析后得到一個(gè)魚(yú)肉抗凍蛋白吸收峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)得知該峰下的蛋白質(zhì)為電泳純的抗凍蛋白，且只含有一個(gè)亞基，其相對(duì)分子質(zhì)量約為7.6 ku，如圖7B所示。此時(shí)，測(cè)定該電泳純的抗凍蛋白的THA約為（0.052 0±0.001 5）℃。

3 結(jié)論

白斑狗魚(yú)魚(yú)肉中抗凍蛋白提取的最佳工藝條件為溫度5.14℃、pH 8.40、提取時(shí)間1.88 h、料液比1∶2（g∶mL），此時(shí)熱滯活性達(dá)到0.061 2℃。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示白斑狗魚(yú)魚(yú)肉中抗凍蛋白的熱滯活性為（0.059 4±0.001 3）℃，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。

利用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱和Sephadex G-50分子篩層析柱對(duì)獲得的抗凍蛋白粗品進(jìn)一步的純化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白斑狗魚(yú)魚(yú)肉組織中的抗凍蛋白粗品經(jīng)過(guò)陰離子交換柱層析后確實(shí)有一個(gè)較明顯的蛋白吸收峰，但是經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)該處的抗凍蛋白樣品為雜蛋白，電泳膠片上蛋白樣品條帶較多，未能達(dá)到電泳純。將經(jīng)過(guò)DEAE-Sepharose FastFlow陰離子交換柱所得的具有活性的蛋白收集合并，然后繼續(xù)通過(guò)Sephadex G-50分子篩層析柱進(jìn)行分離純化，所得的層析圖譜與陰離子柱層析的圖譜相類似，同樣有較明顯的蛋白吸收峰，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，此處的蛋白樣品達(dá)到電泳純，且只含有一個(gè)亞基，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker的相對(duì)遷移率計(jì)算獲得其分子質(zhì)量約為7.6 ku。同時(shí)，測(cè)定該電泳純的抗凍蛋白的THA約為（0.052 0±0.001 5）℃。

[1]RAYMOND J A,DEVRIES A L.Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes[J].P Natl Acad Sci USA,1977,74 (6):2589-2593.

[2]費(fèi)云標(biāo)，魏令波，高素琴，等.沙冬青抗凍蛋白的分離、純化及其理化特性分析[J].科學(xué)通報(bào)，2000，45（20）：2185-2189.

[3]ATICI O,NALBANTOGLU B.Antifreeze proteins in higher plants[J]. Phytochemistry,2003,64(7):1187-1196.

[4]ZHONG Q W,FAN T J.Advances in fish antifreeze protein research[J]. Acta Biochim Biophy Sin,2002,34(2):124-130.

[5]LU C F,WANG H,JIAN L C,et al.Progress in study of plant antifreeze proteins[J].Prog Biochem Biophys,1998,25(3):210-216.

[6]GRIFFITH M,EWART K V.Antifreeze proteins and theirpotentialuse in frozen foods[J].Biotechnol Adv,1995,13(3):375-402.

[7]DAVIES P L,HEW C L.Biochemistry of fish antifreeze proteins[J]. Faseb J,1990,4(8):2460-2468.

[8]張 暉，丁香麗.抗凍蛋自在食品中應(yīng)用研究進(jìn)展及安全性分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，31（5）：455-461.

[9]YEH C M,KAO B Y,PENG H J.Production ofa recombinanttype 1 antifreeze protein analogue by L.lactis and its applications on frozen meat and frozen dough[J].J Agr Food Chem,2009,57(14):6216-6223.

[10]潘振興，鄒奇波，黃衛(wèi)寧.冰結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)長(zhǎng)期凍藏冷凍面團(tuán)抗凍發(fā)酵特性與超微結(jié)構(gòu)的影響[J].食品科學(xué)，2008，29（8）：39-42.

[11]汪少蕓，趙 珺，吳金鴻，等.抗凍蛋白的研究進(jìn)展及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2011，29（4）：50-57.

[12]陶發(fā)琴，王明鵬，王衛(wèi)星，等.響應(yīng)面法優(yōu)化酵母油脂的提取工藝[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2013，28（4）：52-57.

[13]SHIH F F,DAIGLE K W.Preparation and charaeterization ofrice protein isolates[J].J AOCS,2000,77(6):885-888.

[14]李志西，杜雙奎.試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析[M].北京：科學(xué)出版社，2010.

[15]CHALKLEY R J,BURLINGAME A L.Identification of GlcNAcylation sites of peptides and alpha-crystallin using Q-TOF mass spectrometry [J].J Am Soc Mass Spectr,2001,12(10):1106-1113.

Isolation and purification of antifreeze protein from muscle tissues ofEsox lucius

GONG Zilu,TIANTongtong,ZHANGJian*,NIU Yujing,LIU Juan,LITian

(College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Antifreeze protein(AFP)from muscle tissues of Esox lucius was isolated and purified by single factor experiment and response surface methodology.Furthermore,the extraction time,extraction temperature,extraction buffer pH and water to materialratio was comprehensively detected with thermalhysteresis activity(THA)as the evaluation index.Results showed thatthe THA of AFP from muscle tissues of E.lucius was up to 0.061 2℃under the optimized condition of extraction temperature 5.14℃,sample solutions pH 8.40,extraction time 1.88 h and solid to liquid ratio 1∶2(g∶ml).In addition,the verification experiment showed that the THA was(0.059 4±0.001 3)℃,similar to the experimentvalue.After DEAESepharose fastflow anion exchange column and Sephadex G-50 molecular chromatography column purification,AFP of electrophoresis level with 7.6 ku molecularweightwas obtained by furtherchromatographic purification,and the THA was about(0.052±0.001 5)℃.

Esox lucius;antifreeze protein;isolation;purification

Q51

A

0254-5071（2015）02-0120-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.027

2014-12-30

國(guó)家自然科學(xué)基金（31260366）；石河子大學(xué)青年骨干教師培訓(xùn)項(xiàng)目（3152SPXY01027）

鞏子路（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)。

*通訊作者：張 建（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)研究工作。