魏天嬌, 周金泉, 張明超, 魏志軍, 朱毅勇

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095)

銨硝營養(yǎng)對高粱根系細胞膜質(zhì)子泵的影響

魏天嬌, 周金泉, 張明超, 魏志軍, 朱毅勇*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095)

高粱； 銨硝營養(yǎng)； 細胞膜質(zhì)子泵； pH

銨和硝是作物吸收的兩種主要氮素形態(tài)[1]。在旱地土壤中，硝化作用強烈，銨態(tài)氮肥易轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，因此大多數(shù)旱地作物以硝態(tài)氮的吸收為主[2]。但是在酸性與淹水土壤中，硝化作用受到抑制，因此在這些土壤上生長的作物以銨態(tài)氮的吸收為主[3]。從植物營養(yǎng)的角度來看，吸收銨態(tài)氮的過程不需要耗能，但是除了水稻等一些作物能在單一銨態(tài)氮營養(yǎng)正常生長外，大多數(shù)植物會發(fā)生銨中毒[4]。

銨中毒的原因很多，其中最明顯的一個原因就是大量吸收銨態(tài)氮后導(dǎo)致的根際強烈酸化[5,6,7]。研究表明，水稻在這種情況下能夠提高根系細胞膜質(zhì)子泵活性[8]，來維持膜電位。但是到目前為止，還不清楚這是植物在銨態(tài)氮營養(yǎng)下的普遍生理反應(yīng)，還是水稻所特有的生理適應(yīng)能力。雖然在大麥根系中也發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)氮營養(yǎng)下質(zhì)子泵活性增強[9]，但是在該試驗中沒有考慮根際pH值，因此還無法肯定究竟是銨還是pH所造成的結(jié)果。此外，研究也發(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮營養(yǎng)下的玉米根系的細胞膜質(zhì)子泵活性也會受誘導(dǎo)而升高[10]。但是，由于類似的試驗并沒有將所有因素均考慮在內(nèi)，并且在同一作物上進行試驗，因此，究竟哪種因素對質(zhì)子泵的影響更大，其可能的原因是什么？則到目前為止還缺少充分的研究數(shù)據(jù)。

植物細胞膜質(zhì)子泵通過水解ATP產(chǎn)生能量，將氫離子泵出細胞，因此又叫H+-ATPase，其作為細胞膜上的一級運輸?shù)鞍?，不僅維持細胞質(zhì)pH的穩(wěn)定，而且還建立了細胞膜電位，并為各種養(yǎng)分物質(zhì)的運輸提供質(zhì)子驅(qū)動力[11]，在植物營養(yǎng)生理中具有重要的意義。因此，本文選用高粱這種旱地作物，通過在銨硝營養(yǎng)下培養(yǎng)并調(diào)控根際pH，然后分離細胞膜、測定質(zhì)子泵活性，進一步探索植物根系細胞膜質(zhì)子泵對銨硝及根際pH的反應(yīng)，為研究植物的銨硝營養(yǎng)機制提供更多借鑒。

1 材料與方法

1.1 高粱培養(yǎng)

將高粱分別用N 1 mmol/L，即0.5 mmol/L(NH4)2SO4和Ca(NO3)2作為氮源培養(yǎng)，不調(diào)節(jié)營養(yǎng)液的 pH。每次更換營養(yǎng)液后，間隔12 h測定pH，記錄4 d內(nèi)營養(yǎng)液的pH變化。由于銨態(tài)氮營養(yǎng)下，根際酸化，營養(yǎng)液pH下降為3，而硝態(tài)氮營養(yǎng)下，根際堿化，營養(yǎng)液pH上升為7。因此，為了區(qū)分是銨、硝營養(yǎng)，還是由于銨硝營養(yǎng)下不同根際pH對質(zhì)子泵的影響，將另一組同樣處理下的高粱用pH 自動調(diào)節(jié)設(shè)置(NPH-660 NDE，Nissin，Japan)把硝態(tài)氮營養(yǎng)液的pH 值控制在3，而將銨態(tài)氮營養(yǎng)液的pH控制在7，分別用0.1 mmol/L NaOH 或0.05 mmol/L H2SO4實時滴定來調(diào)節(jié)。

1.2 測定和分離方法

1.2.1 高粱根系細胞膜分離 根系細胞膜分離方法參照Yan等[12]的方法，略加修改。高粱培養(yǎng)到三周時，采集根系20 g左右，加入4倍體積預(yù)冷的研磨液，在冰浴中研磨，勻漿用4層紗布過濾后，11500×g下離心10 min，棄沉淀。上清液于87000×g下離心35 min,棄上清液，沉淀用6 mL緩沖液充分懸浮后，加入由右旋糖苷(DextranT500, Sigma)和聚乙二醇(PEG23350, Sigma)的水溶液組成的兩相分離系統(tǒng)并混勻。4℃、720×g下離心，每次離心結(jié)束將分為兩層的上相轉(zhuǎn)移到新的兩相系統(tǒng)中混勻，再依次離心23、15、10、5 min，將最后一次離心后從上相中收集到的膜蛋白用BTP緩沖液稀釋6倍至6倍以上，151200×g下離心40 min。收集到的膜蛋白用1～2 mL BTP緩沖液溶解后分裝，置于-80℃下保存。以上所有操作所用離心機為BECKMAN COUL-TER OptimaTML-80 XP，轉(zhuǎn)頭為SW32 Ti。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測定 用Bradford(G250)比色法測定蛋白質(zhì)含量[13]。

1.2.3 細胞膜H+-ATPase水解活性的測定 測定H+-ATPase水解活性參照Yan等[12]的方法。在相同條件下，以測定失活的膜蛋白為空白，根據(jù)單位時間內(nèi)每1 mg膜蛋白水解產(chǎn)生的無機磷作為活性單位。

通過采用不同的抑制劑測定后，我們得到純度在94%以上細胞膜，為了避免其他可能存在的生物膜上質(zhì)子泵的影響，本試驗測定中均加入NaN3、NaNO3、Na2MoO4三種抑制劑。

1.2.4 細胞膜蛋白凝膠電泳和免疫印跡試驗 用SDS-PAGE分離細胞膜蛋白，具體方法參照狄廷均等[14]，然后將分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)TBST 20℃室溫封閉l h后加入一抗(日本名古屋大學(xué)木下俊則教授贈送的植物細胞膜H+-ATPase多克隆抗體)孵育，再用辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(Sigma)孵育，最后用ECL試劑盒(KPL公司)檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

所有數(shù)據(jù)采用SAS軟件中LSD(P<0. 05)進行處理間雙重比較分析。數(shù)據(jù)均用3次獨立試驗的平均值±標準誤差(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 銨、硝態(tài)氮營養(yǎng)下高粱根系細胞膜上的H+-ATPase活性的比較

2.2 銨硝營養(yǎng)下高粱根系細胞膜H+-ATPase的Vmax與Km比較

2.3 銨、硝態(tài)氮營養(yǎng)下高粱根系細胞膜H+-ATPase蛋白濃度分析

為了研究細胞膜H+-ATPase活性差異產(chǎn)生的原因，本試驗分析了其單位膜蛋白中H+-ATPase蛋白數(shù)量變化。不同處理下的根系細胞膜蛋白(15 μg)經(jīng)SDS PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上后與H+-ATPase的多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)后可以看出(圖3)，銨態(tài)氮營養(yǎng)下根際pH 3時，免疫印跡最深，而硝態(tài)氮營養(yǎng)下根際pH 7時，免疫印跡最淺，硝態(tài)氮營養(yǎng)pH 3時，質(zhì)子泵蛋白的濃度有所增加，而銨態(tài)氮營養(yǎng)pH 7時質(zhì)子泵蛋白的濃度比 pH 3時有所減少。結(jié)合圖1、圖2的結(jié)果，說明單位膜蛋白中質(zhì)子泵蛋白的濃度是決定其活性差異的主要原因。

3 討論

銨態(tài)氮營養(yǎng)下根際pH降低到3，而硝態(tài)氮營養(yǎng)下根際pH上升至7，在此條件下，銨態(tài)氮營養(yǎng)下的高粱根系細胞膜H+-ATPase活性要顯著高于硝態(tài)氮營養(yǎng)，這與我們前期研究水稻的結(jié)果類似[14]。但是，在硝態(tài)氮營養(yǎng)下人為的將根際pH調(diào)至3，則細胞膜H+-ATPase活性比pH 7環(huán)境下要高(圖1)。由于硝態(tài)氮被根系細胞吸收后主要是運輸?shù)降厣喜糠郑蚴琴A存在液泡中，即使在根系中被還原，其還原過程中并不產(chǎn)生H+[15-16]。因此可以推斷，在硝態(tài)氮營養(yǎng)下，高粱根系細胞膜H+-ATPase活性升高完全是由于外界pH 降低導(dǎo)致的。這說明根系細胞膜質(zhì)子泵具有適應(yīng)根際酸化的機制。

但是，在銨態(tài)氮營養(yǎng)下，當(dāng)根際pH上調(diào)到7以后，細胞膜H+-ATPase活性降低了，這同樣說明了細胞膜H+-ATPase是適應(yīng)銨態(tài)氮吸收后根際酸化導(dǎo)致了活性的變化。本試驗發(fā)現(xiàn)，無論是在pH 7還是pH 3的情況下，銨態(tài)氮處理的根系細胞膜H+-ATPase活性均比硝態(tài)氮處理要高 。這個結(jié)果說明，一方面細胞膜H+-ATPase活性確實受到外界pH的影響而變化;另一方面也說明在銨態(tài)氮營養(yǎng)下，還存在其他的原因，導(dǎo)致高粱細胞膜H+-ATPase活性仍然要保持在一個相對較高的水平上。由于銨態(tài)氮吸收以后可以直接在細胞中同化為氨基酸，并產(chǎn)生H+，而細胞膜H+-ATPase的一個重要生理功能是將細胞中多余的H+排出體外，以維持細胞質(zhì)中的pH穩(wěn)定[17]。因此推斷，在銨態(tài)氮營養(yǎng)下，高粱根系細胞內(nèi)部無法消耗掉銨同化產(chǎn)生的氫離子，因此需要通過提高質(zhì)子泵活性將多余的氫離子泵出細胞。

從生理生化的水平來看，酶活性高低的原因取決于兩方面:一是單位面積細胞膜上酶蛋白的數(shù)量差異;二是其同工酶的組成發(fā)生變化，當(dāng)然也可能是上述兩種情況同時發(fā)生[18]。通過在測定時用不同的pH環(huán)境研究H+-ATPase活性后發(fā)現(xiàn)，在銨態(tài)氮營養(yǎng)下，其最高活性范圍在pH 6.0～6.2，而在硝態(tài)氮營養(yǎng)下則上升為pH 6.0～6.4。這說明，在銨硝營養(yǎng)下，其同工酶的組成可能發(fā)生了變化。此外，酶動力學(xué)的測定結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)氮營養(yǎng)pH 3環(huán)境下高粱根系細胞膜上H+-ATPase的Km值最低，這說明H+-ATPase在這種情況下親和能力最強，但是在銨態(tài)氮營養(yǎng)pH 7時，其親和性卻比硝態(tài)氮營養(yǎng)下要低，這也說明其同工酶的組成發(fā)生了變化，導(dǎo)致其親和能力發(fā)生了改變。由于細胞膜H+-ATPase是由一個多基因家族編碼的[19]，因此要具體分析哪些同工酶發(fā)生了變化還需要從分子生物學(xué)的水平上研究其同源基因的表達才能確認，這還有待進一步研究。

通過Western blot 的結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)氮營養(yǎng)pH 3時，免疫印跡最深，而硝態(tài)氮營養(yǎng)下根際pH 7時最淺，其他兩種處理的結(jié)果與上述H+-ATPase活性的變化一致，這說明單位膜蛋白數(shù)量上，質(zhì)子泵酶蛋白數(shù)量的高低是決定其活性的主要原因。

4 結(jié)論

除了外界pH因素外，銨硝營養(yǎng)本身也是影響高粱根系細胞膜質(zhì)子泵活性的一個重要原因，尤其是銨態(tài)氮營養(yǎng)下，細胞膜質(zhì)子泵不僅要響應(yīng)根際低pH對其的影響，同時還要響應(yīng)細胞內(nèi)銨態(tài)氮同化產(chǎn)生的氫離子對其的影響。而水稻等耐銨作物似乎并沒有受到細胞內(nèi)銨態(tài)氮同化產(chǎn)生的氫離子對其的影響，其細胞中存在著調(diào)節(jié)pH的其他機制，因此只要外界pH相同時，銨或硝營養(yǎng)下水稻根系細胞膜質(zhì)子泵活性之間沒有差異[8]。因此，這可能是喜硝作物高粱與喜銨作物之間的一個重要的差別，是不同作物根系細胞膜質(zhì)子泵對銨態(tài)氮營養(yǎng)的不同響應(yīng)機制，其中還涉及到質(zhì)子泵同工酶的變化，相關(guān)的研究有待進一步從分子水平上進行分析。

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WEI Tian-jiao, ZHOU Jin-quan, ZHANG Ming-chao, WEI Zhi-jun，ZHU Yi-yong*

(CollegeofResoursesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

sorghum; ammonium and nitrate; plasma membrane H+-ATPase; pH

2014-06-20 接受日期: 2014-11-03 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2015-05-21

國家自然科學(xué)基金(31172035)；教育部新世紀優(yōu)秀人才項目(NCET-11-0672)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201410307023)資助。

魏天嬌(1992—)，女，吉林公主嶺人，碩士研究生，主要從事植物營養(yǎng)生理與土壤微生物方面的研究。 E-mail: 2012103158@njau.edu.cn。 *通信作者E-mail: yiyong1973@njau.edu.cn

Q945.12

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1008-505X(2015)05-1178-06