張濤

河南省安陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南安陽(yáng)455000

超高效液相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用思路構(gòu)建

張濤

河南省安陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南安陽(yáng)455000

在高通量研究與微量復(fù)雜混合物的分離中超高效液相色譜技術(shù)都具有較高的應(yīng)用價(jià)值，適用于多項(xiàng)研究，比如藥物分子的代謝組合、藥物制劑的組成分析、檢測(cè)分析、質(zhì)量控制等。該研究主要基于超高效液相色譜技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用原理，對(duì)藥物分析中超高效液相色譜法的應(yīng)用給予探討。

藥物分析；超高效液相色譜法；高通量；檢測(cè)分析

在化學(xué)成分領(lǐng)域中，超高效液相色譜法（UPLC）屬于常規(guī)技術(shù)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于藥物分析方面。在藥物分析中，超高效液相色譜法的應(yīng)用，其優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)為樣品處理簡(jiǎn)便、藥物成分分離具有較高的分離效率、易于吸收藥品組分、具有較廣的適用范圍、檢測(cè)具有較高的靈敏度與全自動(dòng)化、分析速度快等，在藥品分析中居于主導(dǎo)地位[1]。隨著科技的不斷發(fā)展與更新，除了具有高效液相色譜的全部?jī)?yōu)點(diǎn)外，超高效液相色譜技術(shù)還具有超高分離效率、靈敏度及速度。

1 超高效液相色譜法原理

理論基礎(chǔ)為范德米特方程，用公式表示為：HETP=AdP+B/v+ CdP2v式中，HETP表示理論塔板高度；A表示渦旋擴(kuò)散系數(shù)；dP表示填料微粒直徑；B表示分子徑向擴(kuò)散系數(shù)；C表示傳質(zhì)因子；v表示流動(dòng)相線速度。此方程具有以下意義：①隨著微粒顆粒度的減小，色譜柱效會(huì)逐漸升高；②每一種微粒的顆粒度尺寸，都具有相對(duì)應(yīng)的最佳色譜柱效流速；③顆粒度越小，線速度范圍越寬；④顆粒度越小，更高流速方向?yàn)樽罡咧c(diǎn)的移動(dòng)方向。最終得出的結(jié)論就是想要色譜柱效和速度得以提高，可以通過(guò)降低顆粒度大小來(lái)實(shí)現(xiàn)[2]。

2 超高效液相色譜法的優(yōu)缺點(diǎn)

2.1 超高效液相色譜法優(yōu)點(diǎn)

與高效液相色譜技術(shù)相比，兩者分離原理相同，但在分離度、靈敏度檢測(cè)與分析速度來(lái)說(shuō)，超高效液相色譜法更加優(yōu)越。①分離度的提高：微粒粒徑的平方根與分離度成反比例關(guān)系，當(dāng)粒徑低于1.7～2 um時(shí)，超高效液相色譜法的應(yīng)用，有利于增高柱效，使1.7 um顆粒的優(yōu)越性得以充分發(fā)揮；②分析速度的提高：1.7 um顆粒為超高效液相色譜法常用粒徑，不僅可以大大縮短柱長(zhǎng)，還可以提高流速，既縮短例分離時(shí)間，也保證了恒定的分離度；③檢測(cè)靈敏度的提高：超高效液相色譜法的應(yīng)用，在降低粒徑的基礎(chǔ)上，使微粒具有更窄的色譜峰，有利于快速提高檢測(cè)的靈敏度[3]。

2.2 超高效液相色譜法的缺點(diǎn)

在實(shí)際運(yùn)用中，超高效液相色譜法存在的不足之處主要表現(xiàn)為：①在應(yīng)用超高效液相色譜法時(shí)，所采用的儀器具有昂貴的價(jià)格，對(duì)其的普遍應(yīng)用于推廣具有一定限制；②對(duì)色譜柱具有較高要求，因此，很難掌握工藝精度，致使生產(chǎn)廠家有限；③進(jìn)樣量過(guò)低，再加上進(jìn)樣方式為半環(huán)式，致使峰面積具有較差的重復(fù)性；④用來(lái)填色譜柱的顆粒比較細(xì)，只有對(duì)樣品的更高要求，才能避免色譜柱的堵塞現(xiàn)象[4]。

3 在藥品分析中超高效液相色譜法的應(yīng)用

3.1 在藥品分析中的應(yīng)用

一般情況下，對(duì)制劑藥品進(jìn)行分析時(shí)，由于樣品量比較少，很難實(shí)現(xiàn)分離，且耗費(fèi)的時(shí)間比較長(zhǎng)，而超高效液相色譜法的應(yīng)用，在分析時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)快速分離，且使檢測(cè)具有較高的靈敏度，為藥物分析提供了準(zhǔn)確的理論支持。使用超高效液相色譜法測(cè)定人凝血因子Ⅷ中枸櫞酸離子含量，試驗(yàn)中離子交換柱為4mm×250 mm，（20 mmol/L）NaOH溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行20min等度洗脫，接著使用電導(dǎo)檢測(cè)器和陰離子印制器（ASRS4mm）對(duì)枸櫞酸離子濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果其濃度范圍為0.1～2.0 ug/mL，枸櫞酸離子濃度正好與對(duì)照品色譜峰呈線性關(guān)系（r=0.9990），結(jié)果表明回收率為97.80%，RSD為0.69%，檢測(cè)限為0.01 ug/mL。在測(cè)定3-羥基地氯雷他定和地氯雷他定時(shí)，超高效液相色譜法的應(yīng)用結(jié)果顯示：準(zhǔn)確度與精確度沒(méi)有任何誤差。此外，在眾多案例中都應(yīng)用的比較成功，比如曲安西隆乳劑、雌激素凝膠、松乳劑等，與高效液相色譜技術(shù)相比較，無(wú)論從分離效率還是分析時(shí)間方面來(lái)說(shuō)，超高效液相色譜法都具有較高的優(yōu)越性。同時(shí)，在藥物合成分析中，超高效液相色譜法也具有較多優(yōu)點(diǎn)，在對(duì)副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物、中間體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，既準(zhǔn)確又快速。

3.2 在藥物代謝動(dòng)力學(xué)中應(yīng)用

在研究藥物代謝動(dòng)力學(xué)方面，對(duì)藥物在體內(nèi)的分布、吸收、代謝、排泄等過(guò)程涉及的比較多，主要針對(duì)的研究情況有藥物分析測(cè)定、在各種復(fù)雜基質(zhì)中藥物的代謝與分離、測(cè)定藥物及代謝物的定量分析等。研究結(jié)果顯示，在對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，超高效液相色譜法的應(yīng)用具有較高的分離效率，并可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的定量分析。在UPLC-MS/MS定量系統(tǒng)中，主要對(duì)人體血漿中喹那普利特和喹那普利給予測(cè)定分析，研究結(jié)果顯示，喹那普利特和喹那普利回收率分別為62.6%與85.8%。僅僅在3min內(nèi)，分析師便可以對(duì)血清中去甲可待因與氯氮平的含量給予測(cè)定，也可以測(cè)定研究人體血漿中利托那韋和洛匹那韋的濃度。綜合多項(xiàng)研究顯示，超高效液相色譜技術(shù)的應(yīng)用具有較高的專屬性、靈敏度、精準(zhǔn)性及快速性。

3.3 在中藥成分分析中應(yīng)用

在中藥中，生物堿的成分比較多，是中藥的活性成分，因此，采用超高效液相色譜法對(duì)中藥成分給予分析具有重要意義。應(yīng)用超高效液相色譜法對(duì)生物堿進(jìn)行分析時(shí)，由于硅羥基殘留在固定相表面，會(huì)改變此類化合物色譜峰的保留行為，致使色譜峰表現(xiàn)為嚴(yán)重展寬或拖尾現(xiàn)象。因此，分析生物堿時(shí)，應(yīng)該在流動(dòng)相中添加相應(yīng)的添加劑。常用的添加劑為有機(jī)胺類、離子對(duì)試劑等，對(duì)固定相表面殘留的硅羥基具有屏蔽作用。而事實(shí)上，添加劑的加入，為L(zhǎng)C-MS的應(yīng)用帶來(lái)諸多不便，而在合成1.7 um顆粒度的填料時(shí)，減少了固定相表面殘余硅羥基，因此，在對(duì)生物堿類樣品進(jìn)行分析時(shí)，只需要在流動(dòng)相中加入酸抑制劑，便可以進(jìn)行有效分離。由于在流動(dòng)相中無(wú)需加入有機(jī)胺類等，在一定程度上減少了對(duì)質(zhì)譜的污染和降低了質(zhì)譜噪音，且流速合適，不需要進(jìn)行分流，促使檢測(cè)靈敏度的進(jìn)一步提高，為中藥分析提供了良好平臺(tái)。

3.4 在生化藥品代謝產(chǎn)物中的分析

應(yīng)用超高效液相色譜法對(duì)小鼠毛發(fā)中組胺（HA）及代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，對(duì)毛發(fā)周期及壽命進(jìn)行探討，該分析方法主要對(duì)小鼠中組胺及1-甲基組胺等進(jìn)行分析。首先使用手性熒光化學(xué)試劑（DBD-F）對(duì)組胺進(jìn)行標(biāo)記，對(duì)其衍生物分離給予分析，由于此方法線性范圍良好，組胺和其他代謝產(chǎn)物的檢測(cè)限為0.11、0.17、1.0、0.21pmol，且還能檢出小鼠毛干與毛根的組胺及其他代謝物濃度。同時(shí)對(duì)毛發(fā)中其他各種化學(xué)合成物進(jìn)行分析研究時(shí)，也可以應(yīng)用超高效液相色譜法。比如采用超高效液相色譜法對(duì)猴血漿中SCH 503034非對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行測(cè)定。由于超高效液相色譜法具有選擇性反應(yīng)檢測(cè)正離子模式，對(duì)SCH 503034非對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，線性范圍均維持在1～2500 ng/mL，測(cè)定結(jié)果顯示，批間平均偏差為1.2%～3.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～10%；批內(nèi)平均偏差為1.3%～5.5%，相對(duì)平均偏差為2.3%～7.8%；在2.5ng/mL時(shí)，異構(gòu)體的回收率為87.2%～90.0%；在50 ng/mL水平時(shí)，異構(gòu)體的回收率為89.1%～90.4%；在1000 ng/mL水平時(shí)，異構(gòu)體的回收率為92.3%～94.3%，其中限定量為1 ng/mL，總之，在該次研究中，超高效液相色譜法具有較高的分離度、靈敏度及分析通量，不僅能對(duì)猴血漿進(jìn)行檢測(cè)，還能對(duì)人、狗、小鼠等血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)。

同時(shí)，在天然藥物代謝產(chǎn)物分析中也可應(yīng)用超高效液相色譜法，由于中藥組成極為復(fù)雜，且其中有效成分多樣化、含量低，而超高效液相色譜法具有較高的靈敏度與分離度，可以有效實(shí)現(xiàn)中藥化學(xué)成分的代謝轉(zhuǎn)化。

總之，在藥物分析中超高效液相色譜技術(shù)的應(yīng)用，屬于一種新型的液相色譜技術(shù)，近年來(lái)，應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，已經(jīng)在藥物分析中具有顯著地位，且為現(xiàn)代色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)。由于其具有分離效率高、耗時(shí)少、進(jìn)樣體積小等優(yōu)點(diǎn)，在藥物代謝產(chǎn)物分析、藥品成分分析、天然藥品成分分析中得到了廣泛應(yīng)用，此分析技術(shù)具有更高的精細(xì)程度、準(zhǔn)確性和高效性。盡管其具有種種缺點(diǎn)，比如容易堵塞色譜柱、對(duì)色譜柱的要求比較高、價(jià)格昂貴、進(jìn)樣量比較少等，但是，隨著填料技術(shù)和進(jìn)樣技術(shù)的發(fā)展，這些缺點(diǎn)與不足都能得到較大的改善，使其更好地應(yīng)用于藥物分析中，促進(jìn)藥物行業(yè)的發(fā)展，為人們提供更好、更優(yōu)質(zhì)的服務(wù)。

[1]鐘艷梅,馮毅凡,郭姣.基于UPLC/Q-TOF MS技術(shù)的白術(shù)藥材化學(xué)成分快速識(shí)別研究[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2015,36(1):72-77.

[2]周瓊,石劍,王桂平.超高效液相色譜分析條件變化對(duì)漢黃芩苷轉(zhuǎn)化因子測(cè)定的影響[J].山東醫(yī)藥,2014,54(36):4-7.

[3]羅玲,黃玉嬋,黃琴，等.UPLC-MS-MS同時(shí)測(cè)定雙黃連粉針中7種活性成分[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(13):80-84.

[4]喬立瑞，Rob Lewis，Alex Hooper，等.UNIFI鑒定未知中藥成分鑒定未知中藥片劑申的化學(xué)成分及推測(cè)其所含藥材[J].實(shí)驗(yàn)與分析,2014(4): 22-25.

Ultra-high Performance Liquid Chromatography in Pharmaceutical Analysis Application Ideas to Build

ZHANG Tao
Anyang Institute for food and drug control of Henan province,Anyang，Henan Province，455000 China

In high-throughput studies of complex mixtures and trace Super HPLC separation techniques have a high value for a number of studies,such as the combination of metabolic drug molecules,composition analysis of pharmaceutical preparations,detection and analysis,quality control,etc.This paper is mainly based on the advantages and disadvantages and application of the principles of UPLC technology for the analysis of drug use super high performance liquid chromatography to give discussed.

Pharmaceutical analysis;High performance liquid chromatography;High throughput;Detection and analysis

R71

A

1672-5654（2015）03（c）-0001-02

2015-01-07）

張濤（1970-），女，甘肅白銀人，本科，副主任藥師，研究方向:食品藥品檢驗(yàn)及食品藥品檢驗(yàn)所管理。