黃瑞芹 李敏264000山東煙臺毓璜頂醫(yī)院

血清饑餓對大鼠血管平滑肌細(xì)胞黏附和鋪展的影響

黃瑞芹 李敏
264000山東煙臺毓璜頂醫(yī)院

目的：探討血清饑餓對大鼠血管平滑肌細(xì)胞黏附和鋪展的影響。方法：培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞，分為對照組與實驗組。對照組給予含10％血清的DMEM，實驗組給予DMEM，比較兩組細(xì)胞黏附數(shù)及鋪展情況。結(jié)果：實驗組平滑肌細(xì)胞黏附數(shù)目平均（127±11）個，對照組細(xì)胞黏附數(shù)目（194±9）個。對照組細(xì)胞鋪展較開，并有偽足伸出，實驗組平滑肌細(xì)胞鋪展效果較差，偽足伸出不明顯。結(jié)論：血清饑餓在一定程度上能抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞的黏附和鋪展。

血清饑餓；平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；黏附；鋪展

動脈粥樣硬化（AS）是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)[1]。研究表明，在動脈粥樣硬化病變早期血管細(xì)胞黏附分子（VCAM-1）主要促使單核細(xì)胞向內(nèi)皮黏附，而T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附表示動脈粥樣硬化形成早期炎癥的開始。因此，本實驗主要研究了血清饑餓對血管平滑肌細(xì)胞黏附和鋪展的影響。

資料與方法

實驗器材：超凈工作臺；CO2培養(yǎng)箱；倒置相差顯微鏡；低溫高速離心機；超聲波清洗器；細(xì)胞計數(shù)板；三用恒溫水箱等。

實驗試劑：單克隆抗α-actin抗體，ABC復(fù)合物，胰蛋白酶；生物素化羊抗小鼠IgG；羅丹明標(biāo)記山羊抗小鼠IgG；新鮮小牛血清、培養(yǎng)基DMEM、尼古丁等。

方法如下：血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的培養(yǎng)：組織塊法培養(yǎng)原代VSMCs：①取8～10周齡雄性大鼠，在無菌條件下取胸主動脈，用PBS緩沖液洗去血污；②將動脈切成2.5～3.0 cm長的小段，在盛有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中剝離外膜、中膜；③縱行剪開動脈，內(nèi)膜朝上平攤于培養(yǎng)皿上，以棉簽或圓鈍的鑷子輕輕刮去內(nèi)皮細(xì)胞；④在培養(yǎng)液中洗凈動脈中膜，平鋪在另1個培養(yǎng)皿內(nèi)，用刀片切成1mm3的組織塊并接種到培養(yǎng)瓶中，按等距排列。加入含20％小牛血清的培養(yǎng)液，塞緊瓶口。為使組織塊不與培養(yǎng)液接觸，將貼有組織塊的一側(cè)朝上，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～6 h后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。每3 d換液1次。細(xì)胞從組織塊邊緣長出時間約4～6 d，1～2周時出現(xiàn)致密的細(xì)胞層。

血清饑餓刺激：①取傳代培養(yǎng)VSMC于6孔培養(yǎng)板中，A（實驗組）：2 mL DMEM；F（對照組）：2 mL含10％血清的DMEM，放在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，0.125％胰蛋白酶溶液消化2～3 s，把細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上消化下來，用DMEM終止胰蛋白酶消化，把細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸浮液。②然后用細(xì)胞計數(shù)板計算A和F培養(yǎng)板中的細(xì)胞密度。③計算后按每孔3×105個加入6孔培養(yǎng)板，補充DMEM至1 mL。④然后再置于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min。⑤培養(yǎng)完后把上層培養(yǎng)液吸去，再用PBS輕輕的清洗1～2遍，把未黏附的細(xì)胞沖洗掉。⑥黏附的細(xì)胞用1 mL甲醛（3.7％）固定。⑦固定后放在倒置顯微鏡下觀察，然后用相機拍照（6孔培養(yǎng)板平均每孔拍9個視野）。⑧數(shù)出黏附細(xì)胞的個數(shù)。

掃描電鏡標(biāo)本的制備：①將DMEM處理的VSMC和含10％血清的DMEM的VSMC懸浮細(xì)胞用0.1 moL/L PBS清洗2次，1 000 r/min離心10 min。②用少量0.1moL/L PBS重懸，將細(xì)胞懸液分別放在蓋玻片上于6孔培養(yǎng)板中室溫靜止10 min。③用生理鹽水輕輕洗滌3次，然后用2.5％戊二醛（pH 7.2～7.4）固定20 min。④用70％、80％、95％和100％酒精，分別處理10 min取出后放再空氣中讓酒精揮發(fā)掉（CO2臨界干燥），真空鍍膜。⑤掃描電鏡下觀察并拍照。

統(tǒng)計方法：兩組間實驗數(shù)據(jù)以（x±s）表示。兩組數(shù)據(jù)的重復(fù)性用函數(shù)STDEV表示。

結(jié)果

血清饑餓抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞的黏附和鋪展：對照組和血清饑餓組的大鼠血管平滑肌細(xì)胞分別以3×105個/mL種到6孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，PBS緩沖液清洗，洗去未黏附的細(xì)胞，3.7％甲醛固定20 min，每孔選9個視野拍照后計數(shù)。實驗組平滑肌細(xì)胞黏附數(shù)目平均（127±11）個，對照組細(xì)胞黏附數(shù)目（194±9）個，實驗組細(xì)胞黏附數(shù)目是對照組的0.656倍，即血清饑餓組細(xì)胞黏附數(shù)目要少于實驗對照組細(xì)胞。

血清饑餓對平滑肌細(xì)胞黏附鋪展的掃描電鏡結(jié)果：分別從兩組細(xì)胞中挑選鋪展效果較好的細(xì)胞進行對比。結(jié)果顯示，血清對照組細(xì)胞鋪展較開，并有偽足伸出，而實驗組平滑肌細(xì)胞鋪展效果較差，偽足伸出不是很明顯。

討論

動脈粥樣硬化時細(xì)胞間質(zhì)（如膠原）沉積增加，血管壁均增厚，管腔變窄，血管壁順應(yīng)性下降，血管平滑肌細(xì)胞均參與這些血管結(jié)構(gòu)和功能的變化。血管平滑肌細(xì)胞是血管壁的主要細(xì)胞成分之一，位于血管壁中膜，也是決定血管構(gòu)型和血管活性的重要因素。血管構(gòu)型和血管活性在許多與心血管系統(tǒng)有關(guān)的疾病中發(fā)生明顯變化。VSMC受多種因素調(diào)節(jié)，是介入術(shù)后血管再狹窄和冠狀動脈粥樣硬化等心血管病變中的主要細(xì)胞成分之一，各種信號途徑和細(xì)胞因子相互作用，協(xié)調(diào)細(xì)胞病理及生理狀態(tài)下的表達和功能。血管內(nèi)皮生長因子能促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增加血管通透性，促進血管滲漏，參與血管形成的啟動過程，是目前已發(fā)現(xiàn)的比較重要和特異的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的正調(diào)節(jié)因子。很多研究表明，血清饑餓可以改變各種類型細(xì)胞的功能，如誘導(dǎo)腎臟近曲小管上皮細(xì)胞再分化、使體外培養(yǎng)的綿羊胚盤細(xì)胞進入G0期等。

[1]芮耀誠.抗動脈粥樣硬化藥物研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)·藥學(xué)分冊，1995，22（5）：257-259.

Influence of serum starvation on the adhesion and spreading out of vascular smooth muscle cell in rat

Huang Ruiqin，Li Min
Yuhuangding Hospitals of Yantai in Shandong 264000

Objective：To explore the influence of serum starvation on the adhesion and spreading out of vascular smooth muscle cell in rat.Methods：Vascular smooth muscle cells in rat cultivated were divided into the control group and the experimental group.The control group were given DMEM containing 10％serum，and the experimental group were given DMEM，then the cell adhesion amount and spreading out of the two groups were compared.Results：The average number of smooth muscle cell adhesion was （127±11）and that of the control group was（194±9）.The cells of the control group spread out and had pseudopod extend，the smooth muscle cells of the experimental group had poorer spreading effect and the pseudopodia was not obvious.Conclusion：Serum starvation inhibited the vascular smooth muscle cell adhesion and spreading out in rat to a certain extent.

Serum starvation；Smooth muscle cells；Cell culture；Adhesion；Spreading out

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.21.1