田宇曦，劉曉艷，張志剛，楊自文

摘要：通過(guò)PCR技術(shù)將2種不同來(lái)源的蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)Bt）cry1Ac蛋白基因克隆到大腸桿菌pGEX-6P-1表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21，采用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并用親和層析法進(jìn)行融合蛋白的純化，純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行玉米螟的室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)。結(jié)果表明，來(lái)自Bt菌株NBIN-866的Cry1Ac蛋白殺玉米螟的LC50為65.39 μg/mL，來(lái)自Bt菌株NBIC-380的Cry1Ac蛋白殺玉米螟的LC50為15.07 μg/mL，后者具有更高的殺蟲(chóng)活性。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)來(lái)自菌株NBIC-380的Cry1Ac氨基酸序列的71位和393位都為絲氨酸S，而NBIN-866的都為脯氨酸P，推測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸的變化可能是影響毒性大小的重要因素。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）;Cry1Ac;融合蛋白;玉米螟;活性比較中圖分類(lèi)號(hào)：S188 ? ? ? ? ? ?中圖分類(lèi)號(hào)：S476 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）23-5742-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.029

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)Bt）是一種土壤革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，具有較廣的殺蟲(chóng)譜。其主要的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)是殺蟲(chóng)晶體蛋白（Insecticidal crystal protein，ICP）[1]。蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等500多種昆蟲(chóng)及線蟲(chóng)等原生動(dòng)物有毒殺活性[2]。目前關(guān)于Cry蛋白中Cry1Ac蛋白結(jié)構(gòu)以及功能方面的研究，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，如在Cry1Ac蛋白末端融合其他蛋白以提高殺蟲(chóng)活性[3-5]或者將另一種蛋白與其一起共表達(dá)來(lái)提高殺蟲(chóng)活性[6]。本研究通過(guò)克隆表達(dá)兩類(lèi)不同來(lái)源的Cry1Ac蛋白，生物測(cè)定發(fā)現(xiàn)對(duì)玉米螟的殺蟲(chóng)活性差異較大，從一級(jí)結(jié)構(gòu)上分析了可能影響毒性大小的氨基酸位點(diǎn)，為后續(xù)該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

菌種：分離自土壤的兩株含有cry1Ac基因的蘇云金芽胞桿菌菌株NBIC-380和NBIN-866以及大腸桿菌菌株DH5α和BL21保存于湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心;pGEX-6P-1購(gòu)自Invitrogen公司;T4連接酶、Ex Taq酶、Bam HI、Sal I、Hind Ⅲ、DNA Marker（各條帶大小依次為23 130、9 416、6 557、4 361、2 322、2 027、564 bp）、即用型蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（各條帶大小依次為200、116、97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、14.3、6.5 kDa）、pMD19-T Simple Vector購(gòu)自TaKaRa公司;透析袋和透析夾購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)（上海）有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司;基因組DNA提取試劑盒（樹(shù)脂型）購(gòu)自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司;細(xì)菌蛋白抽提GST瓊脂糖凝膠和快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京賽馳生物科技有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 ?方法

1.2.1 ?克隆 ?用細(xì)菌總基因組提取試劑盒抽提蘇云金芽胞桿菌NBIC-380和NBIN-866的總基因組，對(duì)于NBIC-380的Cry1Ac，以菌株NBIC-380總基因組為模板，采用引物Cry1A-F：GGATCCATGGATAACAATCCGAACATC，下劃線處是Bam HI酶切位點(diǎn)和Cry1A-R：GTCGACTACACGAACAATCTAAGTCAG，下劃線處是Sal I酶切位點(diǎn)），在PCR條件（94 ℃、1 min;94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、150 s，25個(gè)循環(huán);72 ℃、5min;16 ℃、5 min）下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物命名為2-Cry1Ac;對(duì)于菌株NBIN-866的Cry1Ac，以菌株NBIC-866總基因組為模板，采用引物Cry1A-F和Cry1A-R，在PCR條件（94 ℃、1 min;94 ℃、30 s，49 ℃、30 s，72 ℃、150 s，25個(gè)循環(huán);72 ℃、5 min;16 ℃、5 min）下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物命名為5-Cry1Ac。將PCR產(chǎn)物割膠，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，先連入pMD19-T Simple Vector進(jìn)行TA克隆，通過(guò)藍(lán)白斑篩選、PCR驗(yàn)證和雙酶切驗(yàn)證挑選正確的轉(zhuǎn)化子，送去上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，將正確的轉(zhuǎn)化子通過(guò)Bam HI和Sal Ⅰ雙酶切下來(lái)連入同樣酶雙酶切處理完全的pGEX-6P-1表達(dá)載體，通過(guò)PCR和單酶切驗(yàn)證后將正確的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌BL21。

1.2.2 ?融合蛋白表達(dá)與純化 ?在28 ℃、IPTG終濃度為0.5 mmol/L、誘導(dǎo)5 h進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，參照北京康為世紀(jì)生物科技有限公司細(xì)菌GST融合蛋白抽提說(shuō)明書(shū)，采用GST標(biāo)簽的親和層析純化方法純化融合蛋白，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)，將純化的目的條帶較濃雜帶較少的純化液于4 ℃用透析袋透析過(guò)夜，透析緩沖液采用1倍的磷酸緩沖液。透析后的蛋白質(zhì)采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行濃度測(cè)定。

1.2.3 ?生測(cè)試驗(yàn) ?將透析后的蛋白質(zhì)參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行玉米螟的室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)。采用LD50數(shù)據(jù)處理軟件統(tǒng)計(jì)兩種蛋白質(zhì)的LC50。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?pGEX-6P-1-Cry1Ac原核表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了2個(gè)分別來(lái)自Bt NBIC-380和NBIN-866的2.4 kb的cry1Ac基因片段（圖1A），將TA克隆得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證、雙酶切驗(yàn)證（圖1B）以及測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明該轉(zhuǎn)化子是陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒上兩個(gè)基因片段雙切下來(lái)連入用相同的酶切過(guò)的pGEX-6P-1表達(dá)載體上，通過(guò)PCR驗(yàn)證和單酶切驗(yàn)證（圖1C）表明，2個(gè)基因成功地克隆到了pGEX-6P-1表達(dá)載體上。

2.2 ?大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)與純化結(jié)果

在28 ℃用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h，用親和層析法純化得到了融合蛋白（圖2），融合蛋白分子量大小約為118 kDa。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)以上純化并透析過(guò)的融合蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定，帶有GST標(biāo)簽的2-Cry1Ac和5-Cry1Ac的濃度分別為190 mg/mL和199 μg/mL。

2.3 ?室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

將帶有GST標(biāo)簽的2-Cry1Ac和5-Cry1Ac稀釋成3個(gè)濃度進(jìn)行玉米螟的室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)，采用LD50數(shù)據(jù)處理軟件統(tǒng)計(jì)得到兩種蛋白質(zhì)的LC50分別為15.07和65.39 μg/mL?？梢?jiàn)，2-Cry1Ac殺玉米螟的活性是5-Cry1Ac的4倍以上。

2.4 ?兩種蛋白質(zhì)氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果

因?yàn)?-Cry1Ac殺玉米螟活性是5-Cry1Ac的4倍以上，采用MegAlign軟件將兩種蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)以期找到毒性更高的原因。由圖3可知，在兩種蛋白質(zhì)的核心功能域[2]里，2-Cry1Ac（來(lái)自菌株NBIC-380的Cry1Ac）氨基酸序列的71位為S、393位為S，而5-Cry1Ac（NBIN-866的）分別為P、P，其余序列完全一樣。通過(guò)在MMDB數(shù)據(jù)庫(kù)找到已經(jīng)報(bào)道的Cry1Ac的3D結(jié)構(gòu)（MMDB ID：110041），找到了2-Cry1Ac/5-Cry1Ac氨基酸序列上相應(yīng)的71位和393位，由圖4可知，兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)都是突出在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的表面。P和S都是中性氨基酸，不過(guò)P是非極性氨基酸，而S是極性氨基酸，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域上的71和393位由P變成S后，使蛋白質(zhì)殺玉米螟的活性提高了3倍多，原因還需要進(jìn)一步分析。

3 ?小結(jié)與討論

從2個(gè)來(lái)源的Bt NBIC-380和NBIN-866里PCR分別得到了2-Cry1Ac和5-Cry1Ac，將其克隆到pGEX-6P-1表達(dá)載體上，然后利用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，并進(jìn)行融合蛋白的親和層析柱純化，純化的兩種蛋白質(zhì)中NBIC-380的2-Cry1Ac殺玉米螟的活性約是NBIN-866的5-Cry1Ac的4倍。分析這兩種蛋白質(zhì)的氨基酸序列可知，2-Cry1Ac氨基酸序列的71位為S、393位為S，而5-Cry1Ac分別為P、P，其余序列完全一樣。71位氨基酸位于內(nèi)毒素N內(nèi)，393位氨基酸位于內(nèi)毒素M上（http：//www.rcsb.org/pdb/protein/P05068？ evtc= Suggest& evta= UniProtGene%20Names&evtl=OtherOptions），兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)都是突出在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的表面，P和S都是中性氨基酸，不過(guò)P是非極性氨基酸，而S是極性氨基酸，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域上的71和393位由P變成S后，使蛋白質(zhì)殺玉米螟的活性提高了3倍，推測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸的變化可能是影響毒性大小的重要因素，接下來(lái)將針對(duì)這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)展開(kāi)進(jìn)一步研究。

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