黃 結(jié)，毛瑞豐

（廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530021）

食品安全是人們賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)。食品微生物是影響食品安全的重要因素之一。在食品快速流通及廣泛工業(yè)化生產(chǎn)的今天，使用簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的食品微生物檢驗(yàn)方法是保障食品衛(wèi)生安全的重要途徑。磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）技術(shù)是一項(xiàng)新興技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可重現(xiàn)等特點(diǎn)。該技術(shù)在土壤微生物[1-4]、沉積物微生物[5-6]和地下水微生物[7]等方面已有了很廣泛的應(yīng)用。但在食品微生物中的應(yīng)用報(bào)道并不多。該文對(duì)PLFA技術(shù)的基本原理和方法及其在食品微生物鑒定、分型、溯源和群落結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，為促進(jìn)該技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)方面起到更大的作用。

1 磷脂脂肪酸（PLFA）技術(shù)的基本原理和方法

1.1 基本原理

磷脂脂肪酸（PLFA）是構(gòu)成活體微生物細(xì)胞膜的重要組成部分，在真菌和細(xì)菌的細(xì)胞膜中PLFA分別約占50%和98%[8]。微生物能通過(guò)不同的生化途徑合成不同的PLFA，且細(xì)胞膜中PLFA的成分和含量是相對(duì)穩(wěn)定的，提取之后易于進(jìn)行定性和定量研究[6]。微生物中的PLFA在細(xì)胞死亡后數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)就會(huì)降解，因此檢測(cè)到的PLFA大體上反映的是活體微生物。

不同類群微生物含有PLFA的種類和數(shù)量均不相同，a15/i15/15：0、a16/i16/16：0、16：1w5/1w9/1w7t、a17/i17/17/cy17：0、18：1w5/1w7/1w7t、a19/i19/cy19：0為細(xì)菌的PLFA；18：1w9/2w6/3w6/3w3為真菌的PLFA；10Me16/10Me17/10Me18：0為放線菌的PLFA。此外，部分PLFA僅特異性地存在于某類群微生物的細(xì)胞膜中，如cy17：0和cy19：0是厭氧細(xì)菌的PLFA；16/18：1w7t是好氧細(xì)菌的PLFA。鑒于PLFA和微生物類群存在的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以通過(guò)分析樣品中的PLFA來(lái)研究樣品中微生物的生物量和群落結(jié)構(gòu)，可以通過(guò)分析PLFA構(gòu)成的變化來(lái)研究微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[6]。

1.2 方法

應(yīng)用該技術(shù)首先需要從樣品中提取PLFA。PLFA的提取和測(cè)定是PLFA技術(shù)的關(guān)鍵。PLFA的提取可以參考微生物鑒定自動(dòng)化系統(tǒng)（microbial identification system，MIS）推薦的提取方法進(jìn)行。目前，美國(guó)的MIDI公司已將PLFA技術(shù)商品化，開(kāi)發(fā)了微生物鑒定自動(dòng)化系統(tǒng)。該系統(tǒng)是依據(jù)不同種類微生物PLFA類型和含量的特異性、指示性和穩(wěn)定性，對(duì)微生物進(jìn)行全自動(dòng)鑒定和分析。該系統(tǒng)從微生物的培養(yǎng)、菌的收集、微生物細(xì)胞皂化釋放脂肪酸、脂肪酸甲基化、脂肪酸甲酯的萃取和洗滌、微生物的鑒定、結(jié)果的判斷等制定成一整套完整的標(biāo)準(zhǔn)化程序。系統(tǒng)檢測(cè)出微生物的磷脂脂肪酸圖譜，然后自動(dòng)檢索其內(nèi)置的PIFA圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，給出匹配結(jié)果，完成微生物的鑒定。然后可經(jīng)百分歸一化處理，給出相對(duì)定量數(shù)據(jù)。若鑒定的是樣品微生物群落，可根據(jù)得到的磷脂脂肪酸圖譜多樣性，通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和計(jì)算機(jī)分析軟件等給出樣品微生物的生物量及群落結(jié)構(gòu)多樣性。

2 PLFA技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用

2.1 食品微生物的鑒定

目前，食品微生物的鑒定法大體分成4個(gè)不同水平：菌落、細(xì)胞形態(tài)和生理生化水平；細(xì)胞組分水平；蛋白質(zhì)水平；基因水平。傳統(tǒng)的形態(tài)、生化鑒定操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、靈敏度低，一旦某些表型和生化特征發(fā)生變化，其分類與命名就易出錯(cuò)[9]；采用分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)DNA或RNA進(jìn)行鑒定，其操作技術(shù)要求高，且不能區(qū)分活體與死體DNA，引物序列設(shè)計(jì)具有人工選擇性。PLFA技術(shù)是從細(xì)胞組分水平上鑒定微生物，微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)中普遍含有PLFA成分，且微生物的PLFA與DNA具有高度的同源性[10]。PLFA的組成和含量是相對(duì)穩(wěn)定的，一般可通過(guò)單次試驗(yàn)就能比較準(zhǔn)確地將微生物鑒定到種[11]。湯丹劍[12]對(duì)食品中常見(jiàn)的8株細(xì)菌（保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌）的細(xì)胞脂肪酸成分進(jìn)行檢測(cè)分析，其結(jié)果與傳統(tǒng)分類鑒定方法所得的結(jié)果相符。ODUMERU J A等[13]采用MIS系統(tǒng)對(duì)蠟樣芽胞桿菌、空腸彎曲菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌屬、產(chǎn)毒大腸埃希菌等6種食源性病原菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，MIS鑒定的重復(fù)性蠟樣芽胞桿菌最好，其次為空腸彎曲菌、沙門菌屬。杜春明等[14]對(duì)不同食物來(lái)源的唐菖蒲伯克霍爾德菌中不同致病型菌株的脂肪酸成分進(jìn)行測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)它們的脂肪酸成分基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了唐菖蒲伯克霍爾德菌、椰毒假單胞菌和椰毒假單胞菌酵米面亞種是屬于同一個(gè)種。郭愛(ài)玲等[15]通過(guò)氣相色譜對(duì)食品中常見(jiàn)并已知的15株革蘭氏陰性致病菌的細(xì)胞脂肪酸組分進(jìn)行分析，可以清晰的分出不同屬和不同種之間有明顯的差異。HOFFMANN M等[16]使用脂肪酸甲酯鑒定分析從食品和環(huán)境中分離的30株阪崎腸桿菌，得出脂肪酸的測(cè)定有高度重復(fù)性，可用于快速檢查嬰幼兒配方樣品中的阪崎腸桿菌。呂均等[17]對(duì)武漢市疾病預(yù)防控制中心從食品及食品中毒中檢驗(yàn)分離出的14株病原菌及其所屬種的模式菌株，用氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）對(duì)其進(jìn)行全細(xì)胞脂肪酸組分的分析，結(jié)果表明，各個(gè)屬之間可通過(guò)特征脂肪酸圖譜鑒定出來(lái)，并可通過(guò)雙鍵脂肪酸上的位置差異鑒定出模式菌株與地方菌株。

2.2 食品微生物的分型

PLFA圖譜對(duì)菌株差異非常靈敏，已成功應(yīng)用于食品微生物的分型研究。鄭華英等[18]對(duì)食品中分離出來(lái)的6種沙門氏菌（伊斯特爾本沙門菌、豬霍亂沙門氏菌、德?tīng)柋吧抽T氏菌、阿貢納沙門菌、徹斯特沙門菌、鴨沙門氏菌）在相同的條件下培養(yǎng)，通過(guò)氣相色譜測(cè)定脂肪酸的組成，結(jié)果表明，沙門菌屬中的細(xì)菌在脂肪酸的組成上主要含C12、C16、C18、C19，伊斯特爾本沙門菌、豬霍亂沙門氏菌、德?tīng)柋吧抽T氏菌、阿貢納沙門菌、徹斯特沙門菌、鴨沙門氏菌的氣相色譜圖極其相似，但又并不是完全相同，在組分及含量上表現(xiàn)出一定的差異。秦巧玲等[19]用氣相色譜-質(zhì)譜分析4種已知的志賀氏菌（其中的地方菌株是從食品中分離得到），志賀氏菌脂肪酸成分都具有一定的特征，4個(gè)種之間也表現(xiàn)出一定的差異，同種不同來(lái)源的地方菌株表現(xiàn)出一定差異。GUO A等[20]通過(guò)微生物鑒定系統(tǒng)MIS對(duì)不同食物來(lái)源中分離的22株單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行全細(xì)胞脂肪酸鑒定分析，結(jié)果表明，基于這22株菌的脂肪酸可分成三大組，發(fā)現(xiàn)這跟食物來(lái)源也密切相關(guān)，同一食物源在同一組，不同食物源在不同組。狄慧玲等[21]對(duì)從河北地區(qū)六類食品中分離得到的90株單核細(xì)胞增生李斯特菌（LM）提取脂肪酸，利用MIDI公司Sherlock系統(tǒng)進(jìn)行菌體脂肪酸成分分析，使用SPSS19.0軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及聚類分型，并將脂肪酸分型與傳統(tǒng)的血清分型和分型金標(biāo)準(zhǔn)脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分型進(jìn)行比較，結(jié)果表明，脂肪酸分型法判定LM菌的符合率為96.67%。

2.3 食品微生物的溯源

同種不同來(lái)源菌株的PLFA組分存在細(xì)微差異，對(duì)這些差異數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，可判斷出菌株間的親緣關(guān)系。趙暉等[22]對(duì)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心和中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心各一株標(biāo)準(zhǔn)菌株及從食品中分離的5株單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行脂肪酸組分分析，結(jié)果表明，同種的大部分主要脂肪酸組分是相同的，但不同來(lái)源的菌株間一些微小的脂肪酸組分有差異。因而可以通過(guò)脂肪酸組分的微小差異對(duì)微生物追蹤溯源。

在食品加工中應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行菌株溯源分析，對(duì)推測(cè)污染源、明確污染途徑、預(yù)防和消除產(chǎn)品受微生物破壞等方面具有重要意義。MALFEITO-FERREIRA M等[23]在葡萄酒裝瓶廠和葡萄酒中的菌株進(jìn)行脂肪酸圖譜檢測(cè)，追蹤破壞最終產(chǎn)品的菌株來(lái)源，結(jié)果表明，在精過(guò)濾器的出口確定為接合酵母的來(lái)源，灌裝機(jī)的入口發(fā)現(xiàn)畢赤酵母的來(lái)源。這給廠家消除產(chǎn)品的有害菌株提供了指導(dǎo)方向。HINTON A等[24]使用MIDI脂肪酸甲酯分析對(duì)某商家的家禽加工中的雞肉和燙傷水從一月～六月進(jìn)行彎曲桿菌的監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，從三月～六月的雞肉和燙傷水中檢出病原體，且彎曲桿菌的數(shù)量在家禽尸體冷藏儲(chǔ)存期間普遍下降，這可以幫助商家明確污染源，為預(yù)防和減少病原體采取必要的措施。該技術(shù)也可以應(yīng)用在細(xì)菌性食物中毒查找污染源中，但是這方面的報(bào)道甚少。該技術(shù)可以作為一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的手段快速找出相似菌株，再結(jié)合使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）法對(duì)相似度高的菌株進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，從而為有效提高污染源的控制縮短時(shí)間。

2.4 食品微生物群落結(jié)構(gòu)的分析

微生物群落結(jié)構(gòu)可通過(guò)各微生物類群的特征脂肪酸的相對(duì)含量表征[25]。目前，PLFA只能粗略地區(qū)分革蘭氏陽(yáng)性菌G+、革蘭氏陰性菌G-、好氧細(xì)菌、厭氧細(xì)菌、真菌等。微生物多樣性一直是微生物生態(tài)學(xué)研究的重要內(nèi)容。分析食品不同時(shí)期的微生物群落結(jié)構(gòu)含量變化是反映食品質(zhì)量變化的重要指標(biāo)，這在食品加工、貯存等方面具有重要的指導(dǎo)意義。趙金松等[26]采用PLFA技術(shù)對(duì)4種不同的醬香型大曲進(jìn)行研究，結(jié)果表明，醬香大曲主要由真菌、G+細(xì)菌、G-細(xì)菌等組成，優(yōu)勢(shì)菌群均為真菌，總PLFA含量表現(xiàn)為瀘州老窯大曲＞國(guó)臺(tái)大曲＞郎酒大曲＞仙潭大曲。

3 PLFA技術(shù)存在的不足

雖然PLFA技術(shù)應(yīng)用于微生物研究已有了很長(zhǎng)時(shí)間，但也有不足。

（1）不同種屬之間的PLFA常常會(huì)有所重疊，這個(gè)覆蓋效應(yīng)在鑒定微生物群落結(jié)構(gòu)上會(huì)導(dǎo)致生物量的過(guò)量估算[27]。

（2）PLFA的組成會(huì)受細(xì)胞所處的外部環(huán)境條件的影響，也會(huì)受細(xì)胞內(nèi)部情況的影響[28-29]。有研究指出，一些菌株的細(xì)胞脂肪酸組成和含量會(huì)隨著環(huán)境的溫度、pH值、培養(yǎng)時(shí)間、搖瓶轉(zhuǎn)速、碳源種類和濃度等變化而變化[30-32]。

（3）古菌的極性脂質(zhì)是以醚鍵（二醚與四醚成分）為主[33]，而不是以酯鍵的形式出現(xiàn)，因此不能使用PLFA技術(shù)分析古菌的組成。

（4）對(duì)某些菌落指征有時(shí)不夠準(zhǔn)確，且食品中所有生物的特征PLFA未完全確立。因此還要不斷完善PLFA技術(shù)，完善不同菌種的特定PLFA數(shù)據(jù)庫(kù)。

4 展望

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，PLFA技術(shù)越來(lái)越多地引起人們的重視。PLFA技術(shù)突破了傳統(tǒng)食品微生物檢測(cè)手段的限制，已越來(lái)越多地應(yīng)用于食品微生物的鑒定、分型、溯源和群落結(jié)構(gòu)的研究中。由于PLFA技術(shù)只檢測(cè)活的那部分微生物，并且能有效地提供微生物群落信息，所以，該技術(shù)可以用來(lái)研究發(fā)酵食品加工中特異性微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，為控制和保證產(chǎn)品的質(zhì)量提供技術(shù)支撐。由于該技術(shù)存在一些不足，可研究改進(jìn)試驗(yàn)方案，不斷完善PLFA技術(shù)，并且在進(jìn)行食品微生物溯源、群落組成及變化等研究中，需要與其他技術(shù)方法結(jié)合起來(lái)使用，如核酸技術(shù)、變性凝膠梯度電泳技術(shù)（denatruing gradient gel electrophoresis，DGGE）等，以達(dá)到更好的使用效果。

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