韓 愉，喬洪賓，曹宇凡，陸 珂，李 浩，劉金明，林矯矯，金亞美

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實驗室，上海 200241）

·研究論文·

日本血吸蟲混合與單性感染雌蟲的形態(tài)觀察及凋亡檢測

韓 愉，喬洪賓，曹宇凡，陸 珂，李 浩，劉金明，林矯矯，金亞美

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實驗室，上海 200241）

日本血吸蟲混合與單性感染雌蟲在形態(tài)上存在明顯的差異，為了更進(jìn)一步觀察二者生殖器官的差異，本研究采用激光共聚焦觀察感染雌蟲卵巢和卵黃腺，透射電鏡觀察卵黃腺，并用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法觀察卵黃腺的凋亡水平。激光共聚焦結(jié)果表明，混合感染雌蟲卵巢和卵黃腺可見成熟的細(xì)胞而單性感染雌蟲僅存在未成熟的細(xì)胞；透射電鏡結(jié)果表明兩者卵黃腺細(xì)胞的細(xì)胞核和核仁在大小及形態(tài)方面有很大差異，混合感染雌蟲可見明顯的卵黃滴，單性感染雌蟲無卵黃滴但有聚集和散在分布的脂滴；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法結(jié)果表明，兩者皆未呈現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象?？梢姡旌吓c單性感染雌蟲不僅在蟲體大小和器官形態(tài)上，細(xì)胞形態(tài)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)也存在差異。

混合感染；單性感染；形態(tài)；凋亡；日本血吸蟲

日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）成蟲寄生在宿主肝門靜脈和腸系膜靜脈，性成熟雌蟲在寄生部位持續(xù)產(chǎn)卵，蟲卵一部分隨血流進(jìn)入并滯留于宿主肝臟最終引起宿主肝臟的蟲卵肉芽腫，造成宿主的主要病理危害；另一部分流入腸系膜，引起宿主腸道炎癥進(jìn)而造成組織破潰，最終落入腸腔并隨糞

便排出體外，造成血吸蟲病的進(jìn)一步傳播[1]。雌蟲的性成熟是雌蟲產(chǎn)正常卵的前提，因此有關(guān)雌蟲性發(fā)育成熟的研究或?qū)Ψ揽匮x病具有重要的意義。

血吸蟲雌雄異體，除極個別雌蟲長時間感染后會產(chǎn)生對宿主危害極小的非正常卵外[2]，雌蟲的生殖發(fā)育和產(chǎn)卵需要來自雄蟲的持續(xù)刺激，但這種刺激并非來源于受精作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，單性雌蟲感染宿主后，生殖發(fā)育基本處于阻遏狀態(tài)，與再感染雄蟲相互合抱后依然能發(fā)育為性成熟個體，產(chǎn)正常卵；正常發(fā)育的雌蟲和雄蟲分離后，其成熟的發(fā)育狀態(tài)也會退化為發(fā)育阻礙狀態(tài)，與雄蟲再相遇又會發(fā)育為成熟狀態(tài)。早期研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育阻遏雌蟲的卵巢和卵黃腺，尤其是卵黃腺發(fā)育不完善[4,5]。為了進(jìn)一步了解血吸蟲雌蟲的生殖發(fā)育，本研究對感染后25 d的混合感染雌蟲（mixed-sex infection female, MSIF）和單性感染雌蟲（single-sex infection female, SSIF）進(jìn)行了多方面的細(xì)致觀察，并采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase nice and labeling, TUNEL）對兩者卵黃腺細(xì)胞的凋亡狀態(tài)進(jìn)行了檢測。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器甲醛、乙醇、冰醋酸混合（FAA）固定液的配制：48%無水乙醇、10%甲醛、2%冰醋酸、40%去離子水；鹽酸卡紅染液的配制：取4 g卡紅粉溶于鹽酸蒸餾水中邊加熱邊攪拌至沸騰，再加入85%乙醇 95 mL，冷卻后過濾加氨水調(diào) pH 至7.0備用；透射電鏡的樣本固定液為PBS配制的2.5%戊二醛溶液；DAPI（貨號：40011）為美國Biotium公司產(chǎn)品；鹽酸卡紅（國藥71009382）；凋亡檢測試劑盒（promega，G3250，美國）；4%多聚甲醛（鼎國，ARO211）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon C1Si）；透射電子顯微鏡（FEI T12）；普通光學(xué)解剖鏡（Olympus SZX 10）。

1.2 實驗動物和釘螺 BALB/c（6周齡）小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所血吸蟲研究室提供。以腹部貼片法感染日本血吸蟲尾蚴，為保證有單性感染雌蟲，每1只小鼠僅感染來于1個釘螺釋放的尾蚴。分別于感染后25 d剖殺，以肝門靜脈灌注法收集蟲體，獲得蟲體后隨機(jī)挑選出雌蟲，立即進(jìn)行普通光學(xué)顯微鏡下拍照。充分洗滌后分別于FAA固定液、2.5%戊二醛、4%多聚甲醛中固定，以用于各項試驗；對于合抱蟲體待其在冰水混合PBS中自行分離后挑出雌蟲固定備用。

1.3 激光共聚焦標(biāo)本制備及觀察參考文獻(xiàn)[6]，將蟲體放入 FAA 固定液中過夜充分固定后，取出蟲體后在鹽酸卡紅染液中染色12 h左右，然后用 0.5%鹽酸乙醇脫色，蟲體分別經(jīng) 70%、80%、90%、100%梯度乙醇脫水。脫水后蟲體依次經(jīng)過等體積無水乙醇及二甲苯混合液、純二甲苯透明。蟲體移至載玻片，滴適量中性樹膠，蓋上蓋玻片封固，平放晾干。用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)射波長為488 nm，掃描激發(fā)值為78%，圖像保存為512×512像素類型。

1.4 透射電子顯微鏡觀察卵黃腺將固定于2.5%戊二醛溶液的蟲體取出，采用常規(guī)超薄切片制作方法制作切片，切片厚度約為70 nm。具體操作：樣本清洗→鋨酸固定→梯度脫水→丙酮置換→浸漬→包埋→聚合→修塊和超薄切片→鈾染→鉛染，處理后在透射電子顯微鏡下觀察。在切片過程中，橫切位置為單一蟲體的后2/3位置，此處為混合和單性感染雌蟲卵黃腺所在位置。

1.5 TUNEL 法觀察卵黃腺凋亡現(xiàn)象將4%多聚甲醛溶液固定蟲體用于石蠟包埋并切片，切片厚度5 μm。按照DeadEndTMFluorometric TUNEL （Promega，G3250，美國）試劑盒的操作步驟進(jìn)行脫蠟、洗滌、通透、熒光染色標(biāo)記，終止反應(yīng)后洗滌，用10 μg/ mL DAPI室溫孵育10 min后，用新鮮的去離子水室溫洗滌3遍，每次5 min。加抗熒光淬滅劑后封片并在激光共聚焦顯微鏡下觀察，觀察樣品時各項參數(shù)及激發(fā)光選擇按照試劑盒要求設(shè)置。

2 結(jié)果

2.1 普通光學(xué)顯微鏡下全蟲形態(tài)結(jié)果見圖1。圖中個體較小蟲體為SSIF，個體較大的為MSIF。SSIF無法觀察到膨大的卵巢；兩者腸管均十分明顯，MSIF腸管更發(fā)達(dá)。MSIF消化道和卵巢光鏡下十分明顯，

卵巢已經(jīng)處于雌蟲中間部分。SSIF相對MSIF個體形態(tài)差別十分明顯，且未見明顯的卵巢。

2.2 卵黃腺和卵巢激光共聚焦觀察在MSIF中可見卵巢中既有成熟的卵細(xì)胞也有不成熟的卵細(xì)胞，不成熟的卵細(xì)胞排列緊密，界限不清晰，而成熟的卵細(xì)胞體積大，細(xì)胞間界限清晰，細(xì)胞呈近似球狀，細(xì)胞中間可見一亮點(diǎn)（細(xì)胞核）。在SSIF感染中，卵巢十分小，其中未見成熟的卵細(xì)胞，所有細(xì)胞均呈現(xiàn)為一圓亮點(diǎn)，細(xì)胞間界限不明顯（圖2）。兩者的卵黃腺，同樣有著明顯的差異，MSIF可見靠近表皮處有著顆粒狀，排列緊密但界限明確的成熟細(xì)胞，而SSIF無法觀察到顆粒狀的成熟細(xì)胞，如卵巢一樣只能看到界限不明晰的亮點(diǎn)，即無法觀察到成熟的卵黃腺細(xì)胞。所觀察結(jié)果與文獻(xiàn)[7]報道相符。

2.3 卵黃腺透射電鏡觀察MSIF卵黃腺細(xì)胞（圖3 A）貼近基膜處細(xì)胞細(xì)胞核核仁十分明顯，卵黃腺細(xì)胞中還觀察到明顯的卵黃滴（Vd），里面有數(shù)十個卵黃球（圖3 B）；而SSIF卵黃腺細(xì)胞貼近基膜處細(xì)胞細(xì)胞核核仁（Nu）不明顯，同時在卵黃腺中僅發(fā)現(xiàn)形成囊泡的脂滴，沒有發(fā)現(xiàn)形成囊泡的卵黃滴。2.4 TUNEL凋亡檢測結(jié)果 在對卵黃腺切面的觀察中，兩個樣本的凋亡觀察均不是十分明顯，整個切面僅能觀察到數(shù)個不等的綠色熒光點(diǎn)（圖4）。部分切片甚至沒有觀察到綠色熒光點(diǎn)（圖片未呈現(xiàn)）。

3 討論

早期研究表明，單性感染雌蟲由于缺乏來自雄蟲的刺激而維持在性發(fā)育阻遏狀態(tài)。Serah等[8]通過對曼氏血吸蟲雌蟲卵黃腺細(xì)胞的分化和凋亡觀察，認(rèn)為SSIF的滯育是由于卵黃腺細(xì)胞的凋亡造成的，但其卵黃腺細(xì)胞的分化則與MSIF并無顯著差異。此研究結(jié)論與Den等[9]早期對MSIF與SSIF蟲體DNA合成情況的比較研究結(jié)果不同。Den等[9]研究發(fā)現(xiàn)單性感染的滯育雌蟲的DNA合成顯著低于性發(fā)育正常雌蟲，即SSIF雌蟲卵黃腺細(xì)胞的分化程度顯著低于MSIF。本研究利用TUNEL法，對正常生理狀態(tài)的SSIF和MSIF蟲體卵黃腺的凋亡水平進(jìn)行觀察比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者凋亡水平均不明顯，且二者間并不存在明顯的凋亡狀態(tài)的差異，此結(jié)論與Serah等[8]觀點(diǎn)相左。血吸蟲正常發(fā)育雌蟲為維持每日大量產(chǎn)卵的需求，需大量卵黃細(xì)胞持續(xù)不斷地產(chǎn)生與成熟（每個蟲卵需由一個受精卵細(xì)胞及約20個卵黃細(xì)胞配備而成），大量卵黃細(xì)胞的產(chǎn)生和成熟必然伴隨DNA的大量合成。同時，滯育雌蟲由于不需要形成大量的成熟的卵黃細(xì)胞，其DNA合成水平低下在情理之中，在沒有大量卵黃細(xì)胞的形成前提下，自然也無需進(jìn)行大量的凋亡消耗掉這些細(xì)胞，這也符合生命活動的最有效性，我們的觀察也佐證了此點(diǎn)。

卵黃細(xì)胞的發(fā)育過程分為四個時期，在細(xì)胞成熟的過程中最為明顯的變化是形成卵黃滴，而脂肪酸是卵黃滴的主要成分[4]。脂肪酸是雌蟲卵黃腺的重要能量來源，它不僅為雌蟲卵黃腺細(xì)胞的成熟提供營養(yǎng)支持，還能夠為卵黃細(xì)胞在蟲卵中發(fā)揮作用提供大量的能量儲備，因此脂滴的形成對產(chǎn)生正常蟲卵有十分重要的作用[10]。本研究通過對雌蟲及其卵黃腺細(xì)胞形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)：滯育雌蟲的卵黃腺及其卵巢均未得到良好的發(fā)育，MSIF的卵黃細(xì)胞內(nèi)形成了明顯的卵黃滴，而SSIF的卵黃細(xì)胞內(nèi)雖也有呈一定程度聚集的脂滴，但并未形成典型的囊泡狀的卵黃滴。透射電鏡也發(fā)現(xiàn)，SSIF蟲體卵黃細(xì)胞不具備成熟細(xì)胞的特征，具體表現(xiàn)在核仁的形態(tài)上。核仁與蛋白合成密切相關(guān)，核仁狀態(tài)一定程度上反應(yīng)了細(xì)胞的代謝活動[11]。代謝活動強(qiáng)，蛋白合成能力強(qiáng)的細(xì)胞核仁明顯，而多處于靜止期的細(xì)胞如肌細(xì)胞等核仁則不明顯[12]。CLMS結(jié)果也表明SSIF蟲體在卵巢和卵黃腺中，不存在類似于MSIF的成熟細(xì)胞。由此可見，SSIF的卵黃細(xì)胞絕大部分處于不成熟狀態(tài)，其代謝活動較弱，未進(jìn)行充分的發(fā)育；同樣的情況也表現(xiàn)于卵巢，SSIF卵巢也無發(fā)育成熟的卵細(xì)胞，這也說明滯育雌蟲處于待成熟狀態(tài)。

血吸蟲正常發(fā)育雌蟲產(chǎn)生大量蟲卵是血吸蟲造成宿主病理損害和血吸蟲病傳播的關(guān)鍵，血吸蟲生殖發(fā)育機(jī)理的研究有可能對揭示血吸蟲性成熟機(jī)制及研制抗血吸蟲生殖疫苗或藥物提供重要理論依據(jù)。本研究從形態(tài)和結(jié)構(gòu)上簡單比較了MSIF和SSIF的差異，為后續(xù)MSIF和SSIF發(fā)育差異機(jī)制研究提供了形態(tài)學(xué)方面的基礎(chǔ)。

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MORPHOLOGY AND APOPTOSIS OF FEMALE SCHISTOSOMA JAPONICUM FROM SINGLE-SEX AND MIXED-SEX INFECTIONS

HAN Yu, QIAO Hong-bin, CAO Yu-fan, LU Ke, LI Hao, LIU Jin-ming, LIN Jiao-jiao, JIN Ya-mei
(Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

It is well known that there are striking differences between female worms from single-sex infection or mixed-sex infection. In the present article, the differences in the ovary and vitelline glands of female worms were observed under confocallaser scanning microscopy (CLMS) and transmission electron microscopy(TEM). The terminal deoxynucleotidyl transferase nick end labeling (TUNEL) was also used to detect the vitelline’s apoptosis of those female worms. The CLMS results showed the signif cant differences in size, morphology and cell mature status of ovary and vitelline glands between mixed-sex infection females and single-sex females. In addition, TEM results revealed obvious nuclei and lipid droplets in vetelline glands from mixed-sex infected females but not in single-sex infected females. The apoptosis of vitelline glands were not obvious in both single-sex and mixed-sex infected females. In conclusion, single-sex and mixed-sex infected female worms differed in their size and morphology as well as in cellular status and subcellular structure.

Mixed-sex infection; single-sex infection; morphology; apoptosis; Schistosoma japonicum

S852.735

A

1674-6422（2015）03-0030-06

2015-01-26

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項目(2013JB17)作者簡介：韓愉，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

金亞美， E-mail: yameijin@shvri.ac.cn