郝一妹，張煥容，2

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都610041；2.動(dòng)物醫(yī)學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610041）

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起犢牛腹瀉的重要病原菌。ETEC的致病過(guò)程是細(xì)菌依賴黏附素，在腸道內(nèi)定居、繁殖，然后釋放細(xì)菌毒素引起細(xì)胞壞死和腸道紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致急性腹瀉[1]。黏附素、腸毒素、溶血素等是與其致病過(guò)程有關(guān)的致病因子[2]，某些血清型也與大腸桿菌的致病性有關(guān)。國(guó)外有關(guān)于大腸桿菌的O抗原血清型與腸毒素和黏附素類型之間關(guān)系的相關(guān)研究報(bào)道。本研究檢測(cè)了分離自牦牛腹瀉樣品中的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的血清型和毒力基因攜帶情況，為牦牛源產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌病的預(yù)防和治療提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 分離自川西北甘孜州和阿壩州腹瀉牦牛糞便棉拭子的41株產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，及參 考 菌 株SWUN4598（HlyA、HlyE）、SWUN4608（HlyE、ehxA）由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；參 考 菌 株CVCC215（K99、STa、F4）、CVCC208（STa、987P）、CVCC196（K88、astA），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.2 引物的合成 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]和GenBank上已公布的序列，設(shè)計(jì)了10種毒力基因引物。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 血清型鑒定 參考O抗原血清分型鑒定方法，鑒定41株牦牛源產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的血清型。

1.4 毒力基因PCR檢測(cè) 參照文獻(xiàn)中PCR反應(yīng)條件，優(yōu)化后對(duì)41株牦牛源ETEC的10種毒力基因進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 血清型鑒定 玻片凝集試驗(yàn)顯示41株分離細(xì)菌中，有20種不同的血清型，分別為：O1，O4，O7，O15，O22，O26，O27，O28，O34，O36，O54，O56，O57，O74，O87，O96，O110，O133和O149，其中O1和O15為主要流行的血清型，均占定型菌株的20%（8/40）。定型菌株存在一定比例的常見致病性血清型：O1（8），O15（8），O22（1），O26（1）和O36（1），常見致病性菌株比例為47.5%（19/40）。有1株未能確定血清型。

2.2 毒力基因的分布 41株牦牛源ETEC菌株均含有K99基因，攜帶astA，ehxA，HlyA，HlyE，STa基因的菌株數(shù)分別為25，23，15，5，4。LT、K88、987P和F41在這41株菌中均未檢測(cè)到。13株細(xì)菌擁有3個(gè)毒力基因，K99+astA+ehxA、K99+astA+HlyA和K99+HlyA+ehxA、K99+ehxA+STa分別有5、4、3株和1株。11株細(xì)菌有4個(gè)毒力基因，其中K99+astA+ehxA+HlyA有8株，K99+astA+HlyA+HlyE有2株，K99+ehxA+HlyA+HlyE有1株。有2株細(xì)菌有5個(gè)毒力基因，分別為K99+astA+ehxA+HlyA+HlyE和K99+astA+ehxA+HlyA+STa。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)分離自四川甘孜州和阿壩州兩藏區(qū)牦牛腹瀉樣品中的ETEC采用O抗原血清型鑒定，結(jié)果表明，樣品中的ETEC存在多種血清型，O1和O15為主要流行的血清型。本試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的牛源ETEC的流行血清型存在一定的相似性，也具有一定的差異性。

黏附素、腸毒素、溶血素是ETEC致病因子[3]。黏附素主要由K99、K88、987P、F41等菌毛基因編碼，其中K99的分布最為廣泛，且為牛、羊、豬等牲畜所共有[4]。本試驗(yàn)中，41株ETEC中均攜帶有K99菌毛基因，未檢測(cè)到其他3種菌毛基因。溶血素基因雖為腸出血性大腸桿菌（EHEC）的靶基因之一[5]，但也存在于ETEC菌株[6]，Smith在1967年報(bào)道大腸桿菌的溶血性可遺傳轉(zhuǎn)移，試驗(yàn)結(jié)果顯示，溶血性大腸桿菌的靶基因HlyA在本次鑒定的牦牛源ETEC中的攜帶率高達(dá)37%（15/41），與相關(guān)報(bào)道一致。astA基因主要分布在腸致病性大腸桿菌中[7]，在產(chǎn)志賀菌毒素大腸桿菌中有檢出[8]，但在本試驗(yàn)的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌中也有檢出，且檢出比例高。本試驗(yàn)對(duì)牦牛腹瀉樣品中分離的ETEC的血清型和毒力基因的研究豐富了大腸桿菌的毒力基因研究的相關(guān)資料，為進(jìn)一步研究牦牛源ETEC的致病機(jī)理和防治措施提供了一定的理論依據(jù)。

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