賀文欣　姜麗娜蔡　輝李柏青(蚌埠醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，安徽　蚌埠　233030)

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人中性粒細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌殺傷活性的檢測(cè)方法

賀文欣姜麗娜1蔡輝1李柏青1(蚌埠醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，安徽蚌埠233030)

〔摘要〕目的探討用FDA標(biāo)記Mtb的最佳濃度，觀察不同化學(xué)試劑和溫度對(duì)FDA標(biāo)記率的影響及PMNs殺傷Mtb的活性。方法用不同濃度熒光素二醋酸酯(FDA)標(biāo)記Mtb，選取最佳標(biāo)記濃度，在0℃冰浴，37℃、65℃和95℃水浴中孵育30 min，或與不同百分比的乙醇、甲醛和多聚甲醛(PFA)試劑在室溫下孵育30 min后洗滌，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)記率和熒光強(qiáng)度(MFI); Percoll分離獲得PMNs與FDA標(biāo)記的Mtb于37℃孵育7 min，洗滌，加入自體血清，置37℃孵育0～60 min，計(jì)算PMNs對(duì)Mtb的殺傷率。結(jié)果Mtb用不同濃度FDA在PBS中標(biāo)記的標(biāo)記率分別從由85%增加到99%，MFI分別從45增加到1 506;在0℃冰浴，37℃、65℃、95℃水浴作用30 min后，F(xiàn)DA-Mtb的標(biāo)記率從0℃的99%下降至95℃的0. 21%，MFI從0℃的2 015下降至95℃時(shí)的87; FDA標(biāo)記的Mtb與不同比例的常規(guī)化學(xué)試劑乙醇、甲醛、多聚甲醛分別作用30 min后，F(xiàn)DA-Mtb的MFI在各組均顯著降低(P＜0. 01); FDA標(biāo)記的Mtb與分離PMNs在37℃作用0 min、10 min、30 min和60 min，PMNs殺傷Mtb的百分率分別是11. 37%、12. 02%、27. 20%、58. 44%。結(jié)論流式細(xì)胞術(shù)能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)PMN對(duì)FDA標(biāo)記Mtb的殺傷活性，且殺傷活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。

〔關(guān)鍵詞〕中性粒細(xì)胞;結(jié)核分枝桿菌

1蚌埠醫(yī)學(xué)院感染與免疫安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

第一作者:賀文欣(1980-)，男，碩士，講師，主要從事細(xì)胞免疫、神經(jīng)生物學(xué)研究。

中性粒細(xì)胞即多形核細(xì)胞(PMNs)，是機(jī)體最重要的炎性細(xì)胞，當(dāng)外來(lái)病原體進(jìn)入機(jī)體時(shí)，PMNs就會(huì)向病原體處集結(jié)，進(jìn)行吞噬活動(dòng)，繼而消化和降解病原體，發(fā)揮天然免疫清除病原體的效應(yīng)〔1～3〕。以往的研究表明，機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌(Mtb)后，發(fā)揮抗結(jié)核免疫主要是細(xì)胞免疫，且在急性結(jié)核病發(fā)病早期，PMNs首先吞噬Mtb，并且PMNs是活動(dòng)性肺結(jié)核病人感染過(guò)程中占最主導(dǎo)地位的吞噬細(xì)胞〔4～6〕，但其發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)卻絕不僅僅是簡(jiǎn)單的吞噬作用。以往用于評(píng)價(jià)Mtb殺傷活性的方法由于受到Mtb生長(zhǎng)緩慢的限制，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，而且操作繁瑣，影響因素較多，因此并不理想。據(jù)此，尋找新的檢測(cè)Mtb殺傷活性的方法尤為重要。本文希望為檢測(cè)Mtb殺傷活性尋找一種快速簡(jiǎn)便的方法。

1　材料與方法

1. 1 Mtb的培養(yǎng)和懸液的制備Mtb H37Ra(批號(hào): 9302025)，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所北京菌種保藏中心。將Mtb H37Ra培養(yǎng)于含有10%小牛血清的改良蘇通氏液體培養(yǎng)基中，并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，當(dāng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)(約1個(gè)月)，用無(wú)菌接種環(huán)取出部分菌接種到羅琴氏固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。當(dāng)固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出新鮮成蔟的Mtb時(shí)，用無(wú)菌接種環(huán)取少許Mtb置于EP管中，用研磨棒進(jìn)行反復(fù)研磨，加入生理鹽水洗滌2次，離心10 000 r/min，2 min，再用1 ml注射器加入少許0. 9% NaCl對(duì)細(xì)菌懸液反復(fù)吹打，使其分散為單個(gè)菌懸液。分光光度計(jì)600 nm處檢測(cè)菌液濃度，用0. 9% NaCl調(diào)細(xì)菌濃度為5× 108/ml，分裝EP管中，置于4℃冰箱待用。

1. 2熒光素標(biāo)記Mtb的制備取Mtb懸液，離心13 000 r/min，2 min，用磷酸鹽緩沖液PBS(pH7. 2)配成濃度為5×108/ml的懸液，加入DMSO配制的FDA溶液(100 μmol/L)，F(xiàn)DA終濃度為0. 025～2. 0 μmol/L，然后置37℃25 min后，離心13 000 r/min，2 min，棄上清，PBS洗滌2次;配成濃度為5× 108/ml細(xì)菌懸液，避光保存于4℃?zhèn)溆?。流式?xì)胞術(shù)檢測(cè)Mtb標(biāo)記率及FDA標(biāo)記的Mtb存活率，取5×108/ml未標(biāo)記Mtb菌液100 μl，加入DMSO配制的FDA溶液(100 μM)1 μl，然后置37℃25 min后，離心13 000 r/min，2 min，棄上清，PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Mtb的FDA標(biāo)記率。

1. 3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)溫度對(duì)FDA標(biāo)記的Mtb存活率的影響將存活率＞95%的FDA標(biāo)記的Mtb 100 μl分別放置在0℃冰浴，37℃、65℃和95℃水浴中，30 min后取出，PBS洗滌2次，每次離心13 000 r/min，2 min，棄上清，重懸，再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每個(gè)樣品收集1×104個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)Mtb的FDA陽(yáng)性率和陰性率。

1. 4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同常規(guī)化學(xué)試劑對(duì)FDA標(biāo)記的Mtb存活率的影響將存活率＞95%的FDA標(biāo)記的Mtb 100 μl加入1. 5 ml EP管中，每管各加入終比例為55%、65%、75%乙醇、50%、75%、95%甲醛和0. 5%、1%、2%的多聚甲醛試劑，室溫下放置30 min，PBS洗滌2次，每次離心13 000 r/min，2 min，棄上清，重懸，再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1. 5 PMN的分離采集健康自愿者(均來(lái)自本院健康教職工和學(xué)生)外周靜脈血5 ml，經(jīng)1 500 r/min水平離心5 min后，取紅細(xì)胞上的“白膜”層，用1 ml 1640稀釋，繼續(xù)在玻璃離心試管中依次加入75%與60% Percoll液和1640稀釋的“白膜”層，三者體積比為2∶2∶1，2 000 r/min水平離心20 min，吸取60%與75% Percoll液的界面層中PMN，用完全1640充分洗脫P(yáng)ercoll膠粒后，加入滅菌純凈水2 ml振搖20～30 s，迅速加入2 ml 1. 8%NaCl溶液混勻，1 500 r/min水平離心5 min后，用完全1640制成濃度為1×106/ml的細(xì)胞懸液。

1. 6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人外周血分離的PMN對(duì)FDA標(biāo)記Mtb的殺傷率取流式管，每管加入已分離的1×106/ml的PMN細(xì)胞懸液25 μl，再加入5×108/ml FDA標(biāo)記的Mtb菌液20 μl，混勻后置37℃水浴，7 min后迅速取出，加冰冷的PBS洗滌1次后再用冰冷的RPMI1640洗滌一次，后加入自體血清20 μl/管，然后分成兩組置0℃冰浴和37℃水浴，每管分別在0、10、30和60 min時(shí)間段，立即加入100 μl 1%的脫氧膽酸鈉(DOC)并在原溫度下保持5 min，再加入無(wú)菌三蒸水，250 μl/管，2 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。同時(shí)設(shè)定全血加入未標(biāo)記細(xì)菌組(空白對(duì)照)。

1. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16. 0軟件行單因素方差分析(one-way ANOVA)及q檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2. 1不同濃度熒光素FDA對(duì)Mtb標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度(MFI)的影響不同濃度FDA標(biāo)記Mtb標(biāo)記率0. 1、0. 5、1. 0 μmol/L FDA的標(biāo)記率分別為83. 33%、99. 56%、99. 67%。有顯著性差異(P＜0. 01)，隨著FDA濃度增加標(biāo)記率逐漸增高。不同濃度FDA標(biāo)記的Mtb-MFI有顯著性差異(P＜0. 01)，F(xiàn)DA濃度為0. 01、0. 5、1. 0 μmol/L時(shí)MFI分別為49. 73±8. 53、208. 64±2. 93、784. 75±15. 94、1 463. 82±33. 49。

2. 2溫度對(duì)FDA標(biāo)記的Mtb存活率的影響存活率＞95%的FDA標(biāo)記的Mtb 100 μl在不同溫度下作用30 min后，隨著溫度的升高，不同溫度對(duì)FDA-Mtb的標(biāo)記率即存活率有顯著影響(P＜0. 01)，標(biāo)記率隨溫度增加而降低;而且，用不同溫度作用FDA-Mtb時(shí)，溫度對(duì)MFI也有不同影響。不同溫度對(duì)FDA標(biāo)記的Mtb-MFI有顯著性差異(P＜0. 01)，0℃、37℃、65℃、95℃時(shí)mFI分別為200 1. 64±594. 83，1 038. 94±89. 47，64. 85±11. 72，48. 42±19. 03。

2. 3不同常規(guī)化學(xué)試劑對(duì)FDA標(biāo)記的Mtb存活率的影響存活率＞95%的FDA標(biāo)記的Mtb 100 μl在不同化學(xué)試劑作用30 min后，發(fā)現(xiàn)隨著加入試劑百分率的增加，同一化學(xué)試劑對(duì)FDA-Mtb的MFI有顯著影響(P＜0. 01)，在乙醇組，MFI從對(duì)照組的1 597下降至325;甲醛組下降至118，多聚甲醛組下降至185，MFI均隨著加入試劑百分率的增加而下降。

2. 4分離PMN對(duì)FDA標(biāo)記的Mtb的殺傷的時(shí)間動(dòng)力學(xué)Mtb與分離PMN在37℃作用0、10、30和60 min，PMN殺傷Mtb的百分率分別是11. 37、12. 02、27. 20、58. 44。兩者在37℃作用0～60 min PMN殺傷Mtb的百分率呈遞增趨勢(shì)(P＜0. 01)。

3　討論

PMN作為職業(yè)吞噬細(xì)胞，在機(jī)體的抗感染免疫中扮演著重要的角色，是機(jī)體最重要的炎性細(xì)胞，在急性感染早期發(fā)揮重要的作用。在炎癥反應(yīng)中，PMN到達(dá)炎癥發(fā)生的部位，其表面有可識(shí)別細(xì)菌的受體，吞噬病原體的過(guò)程包括趨化、識(shí)別結(jié)合、內(nèi)吞、氧依賴性殺傷和氧非依賴性殺傷等。以往的研究表明，在急性結(jié)核病發(fā)病早期，PMNs首先吞噬Mtb〔7～9〕，并且PMNs是活動(dòng)性肺結(jié)核病人感染過(guò)程中占最主導(dǎo)地位的吞噬細(xì)胞，而其發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)卻絕不僅僅是簡(jiǎn)單的吞噬作用，要比以往研究的其所發(fā)揮的作用復(fù)雜得多。Scott等〔10〕曾經(jīng)建立了較為新型的檢測(cè)Mtb藥敏實(shí)驗(yàn)的方法，即通過(guò)熒光素二醋酸乙酯(FDA)標(biāo)記Mtb，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗Mtb藥物活性，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。特別是其操作時(shí)間短暫，24 h內(nèi)就可以獲得結(jié)果。FDA可作為活細(xì)胞染料，能夠輕易地通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)存在的酯酶水解，保留在細(xì)胞內(nèi)呈較強(qiáng)的綠色熒光，而壞死和凋亡的細(xì)胞，則不發(fā)熒光。

通過(guò)本文實(shí)驗(yàn)，我們明確了用FDA來(lái)標(biāo)記Mtb，都可以用流式細(xì)胞儀快速準(zhǔn)確地檢測(cè)其標(biāo)記率和MFI，并且標(biāo)記率和MFI反映的就是Mtb的存活率。PMN殺傷Mtb的量隨時(shí)間呈增加趨勢(shì)，且在30 min左右殺傷值增加較為明顯。實(shí)驗(yàn)中體會(huì)到，PMN吞噬和殺傷Mtb是連續(xù)的過(guò)程，并且受溫度影響較大，因此控制整個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果甚為重要。洗滌的過(guò)程全部用4℃的冰冷的PBS進(jìn)行，在全血組用氯化銨溶解紅細(xì)胞時(shí)，將操作放置在15℃～18℃的水浴中進(jìn)行，這樣也能避免復(fù)雜操作引起的細(xì)胞活化而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的改變。用1%的脫氧膽酸鈉(DOC)和冰冷三蒸水來(lái)使殘留的熒光素與PMN分離，并且破裂細(xì)胞使其漏出，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PMN對(duì)Mtb殺傷活性的影響，所需標(biāo)本量少，檢測(cè)快速、簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確?？傊緦?shí)驗(yàn)通過(guò)用熒光染料和流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)了FDA對(duì)Mtb的標(biāo)記率，以及體外因素對(duì)標(biāo)記率的影響，并且用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了分離PMN對(duì)不熒光素標(biāo)記的Mtb殺傷的時(shí)間動(dòng)力學(xué)，為今后本實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞術(shù)研究和臨床抗結(jié)核的輔助治療提供了依據(jù)。

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〔2014-12-25修回〕

(編輯徐杰)

基金項(xiàng)目:感染與免疫安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(蚌埠醫(yī)學(xué)院)開(kāi)放課題(BYKL1302)

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)20-5689-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 005

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔中圖分類號(hào)〕R378