占玲俊，唐 軍，秦 川

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

PD－1：PD－L1/PD－L2通路在結核感染中的免疫作用

占玲俊，唐 軍，秦 川

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

PD－1：PD－L1/PD－L2通路在腫瘤和某些感染性疾病中發(fā)揮免疫抑制作用，而在結核病中的免疫作用尚不明確。結核菌感染后，免疫細胞上PD－1：PD－L1/PD－L2通路高表達，體外實驗顯示：用該通路的抗體阻斷后保護性T細胞增強，而體內免疫作用不明確。PD－1與配體PD－L1結合后可能發(fā)揮免疫抑制作用，其中 PD－L1表達受Th1細胞因子調控;PD－1與配體PD－L2結合后可能發(fā)揮免疫保護作用，其中PD－L2表達受Th2型細胞因子調控。利用Cas9－CRISPR基因敲除方法分別敲除特定免疫細胞上PD－1、PD－L1和PD－L2，可研究PD－1、PD－L1和PD－L2在結核感染中免疫作用及機制，為結核病的防控提供理論依據(jù)。

PD－1：PD－L1/PD－L2通路 結核感染 免疫作用

結核病是免疫相關的感染性疾病，T細胞、APC (巨噬細胞、DC）等是重要的免疫細胞［1－3］。結核菌進入機體后，首先被巨噬細胞吞噬，當巨噬細胞的殺傷力強于結核菌的毒力時，結核菌被清除，反之，結核菌裂解巨噬細胞產生病變，繼而感染其他巨噬細胞，導致感染播散［2］。此外，結核菌還經(jīng)APC進行抗原加工并提呈給T細胞，刺激免疫應答的產生，通過IFN－+CD4+T細胞和IFN－+CD8+T細胞［1－2］發(fā)揮免疫保護作用，通過分泌 IL－17細胞因子的Treg細胞［3］發(fā)揮免疫抑制作用，感染的結果取決于保護性免疫和抑制性免疫抗衡的結果。

1 程序性死亡配體-1(PD-1）通路與免疫

PD－1通路包括PD－1及兩個配體PD－L1和PDL2。PD－1主要表達于CD4+T細胞，PD－L1表達于T細胞和APC(單核/巨噬細胞，DC和B細胞）表面，PD－L2表達于炎性巨噬細胞、DC、B1細胞表面。在病原或某些抗原蛋白誘導下，PD－L1、PD－L2均可表達于T細胞，PD－L1的表達受Th1細胞調控，PD－L2的表達受Th2細胞調控［4］。

在腫瘤、自身免疫病和某些持續(xù)性感染病(包括病毒如HIV、HCV等、細菌、寄生蟲和真菌感染）中，PD－1：PD－L1/PD－L2通路向T細胞傳遞抑制性第二信號，導致T細胞“無能”或“耗竭”，從而發(fā)?。?］。雖然PD－1：PD－L1/PD－L2通路整體發(fā)揮免疫抑制作用，但其中PD－L1和PD－L2可能發(fā)揮相反的免疫作用。PD－L1能分別與PD－1和B7－1作用，發(fā)揮免疫抑制作用;PD－L2能分別與PD－1和B7－2作用，發(fā)揮免疫保護作用［6－7］。

2 PD-1：PD-L1/PD-L2通路與結核感染

在活動性結核病人中，T細胞、單核/巨噬細胞及B細胞上PD－1、PD－L1和PD－L2的表達均明顯上升，以PD－L1表達升高為主要特點。其中T細胞上以PD－1升高為主;單核巨噬細胞和B細胞以PD－L1為主，PD－1和PD－L2的表達也升高，表達水平接近。

體外實驗證明：用PD－1、PD－L1和PD－L2的單抗分別阻斷結核病人外周血T細胞上PD－1、單核細胞上 PD－L1/PD－L2、或聯(lián)合阻斷 PD－1和 PD－L1/ PD－L2，均能挽救保護性的IFN－+－CD3+T細胞，并且保護性IFN－分泌增加，提示PD－1：PD－L1/PD－L2通路抑制抗結核的保護性免疫［8－9］。

BCG感染小鼠后，PD－1敲除的C57小鼠脾組織荷菌量比C57野生小鼠明顯低，PD－1：PD－L1作用使Th1型細胞免疫受損，提示：敲除PD－1對結核感染產生保護性免疫。而H37Rv感染PD－1敲除的C57小鼠后，肺組織病變比C57野生鼠重，肺、脾組織荷菌量也比野生小鼠高［10］，提示：PD－1幫助清除小鼠體內的H37Rv結核菌，但不能確定PD－1是否有免疫抑制作用［11］。

深入分析可知：BCG和H37Rv感染后PD－1通路免疫作用不同，可能與PD－L1、PD－L2的表達差異有關。BCG感染后，PD－L1高表達，而PD－L2表達無明顯變化。PD－1：PD－L1使Th1型細胞免疫受損，PD－1敲除后可以拯救Th1型細胞免疫，表現(xiàn)出免疫保護作用，即脾組織荷菌量比野生小鼠低［10］。H37Rv感染后，PD－L1和PD－L2均高表達，PD－1： PD－L1可能發(fā)揮免疫抑制作用，而PD－1：PD－L2可能發(fā)揮免疫保護作用［11］。

3 結核感染中PD-1：PD-L1/PD-L2的免疫作用機制

用抗體阻斷結核病人外周血淋巴細胞上PD－1： PD－L1/PD－L2通路后，特異性脫顆粒的CD8+T細胞和IFN－+－CD3+T細胞升高，提示結核急性感染中PD－1：PD－L1/PD－L2通路能抑制效應CD8+T細胞功能［12］和IFN－+－CD3+T細胞功能。其中PD－1、PDL1和PD－L2的作用機制各有特點。

(1）結核中PD－L1、PD－L2的免疫作用機制：用PD－L1抗體治療敗血癥引起的肝損傷，可逆轉因T細胞耗竭而致的肝損傷［13］。在哮喘、氣道變態(tài)反應疾病中研究發(fā)現(xiàn)：PD－L1與PD－1和B7－1結合后，可抑制T細胞增殖。用抗體阻斷PD－L1后，IFN－表達上調;單獨阻斷PD－L1與B7－1結合，對IFN－分泌無明顯影響，提示PD－1：PD－L1能抑制NKT細胞產生IFN－。PD－L2主要通過影響CD4+T細胞的增殖及細胞因子或共刺激分子的分泌來發(fā)揮免疫作用，PD－L2的作用可以不依賴PD－1［6，14］。Treg或NKT細胞也可參與PD－L2的免疫作用。結核中PD－L1和PD－L2的免疫作用機制可能與上述疾病中類似。

(2）PD－L1可能的作用機制：與潛伏感染相比，活動性結核病人中高表達PD－L1的嗜中性粒細胞顯著增加［15］，而嗜中性粒細胞在小鼠結核中有病理損傷作用，提示PD－L1可能介導嗜中性粒細胞聚集所致的免疫病理損傷［16］。H37Rv感染人單核細胞后，PD－L1、PD－L2表達都明顯增高，PD－L1水平高于PD－L2;用單抗阻斷PD－L1后，IFN－+T細胞增殖明顯、凋亡減少，提示PD－L1可抑制保護性T細胞增殖、促進其凋亡。

(3）PD－L1和PD－1的免疫抑制作用機制不完全相同：在腫瘤和多種慢性感染中，PD－1：PD－L1作用均被證實能抑制T細胞的保護性免疫［5，13，17］，其免疫抑制作用在結核的體外實驗中也得到證實［8，18－20］。PD－1表達于活化的T細胞、B細胞、NK細胞、DC細胞和單核細胞表面，也表達于“耗竭”的T細胞表面。PD－1通過與PD－L1、PD－L2結合，抑制T細胞的TCR信號，下調免疫激活因子和存活相關的蛋白表達，促進免疫抑制因子IL－10的表達。而表達于APC上的PD－L1是MAPK/細胞因子/STAT－3依賴模式：在STAT－3調控下，TLR－APC高表達IL－ 6和IL－10，抑制STAT－3的活化，從而阻斷PD－L1的表達［21］。因此，阻斷PD－1和PD－L1后免疫反應存在差異。

(4）結核感染中PD－L1、PD－L2的表達和調控：結核病人中Th1(CD4+T細胞）和 Th2(CD8+T細胞）細胞均發(fā)揮免疫作用。Th1和Th2細胞在BCG與H37Rv感染的小鼠中表達有差異：BCG感染中期，發(fā)揮免疫保護作用的主要是Th1細胞，Th2細胞的免疫保護作用很微弱;而H37Rv感染小鼠后，Th1細胞和Th2細胞均發(fā)揮作用。PD－L1和PD－L2的表達分別由Th1和 Th2細胞來調控，在LPS、Th1型細胞因子IFN－刺激下，巨噬細胞上PD－L1的表達調控依賴STAT1，而Th2型細胞因子IL－4刺激炎性巨噬細胞上 PD－L2表達，其表達調控依賴STAT6［7］。BCG感染DC細胞后，PD－L2高表達，其表達依賴于IL－10，通過TLR2－p38 MAPK信號通路來調控［22］。

4 結語

PD－1：PD－L1/PD－L2通路與結核感染有很大的相關性，而具體的免疫作用和機制還未深入進行，可以在細胞和動物水平用特異性基因敲除技術研究PD－L1和PD－L2的免疫作用及相關的機制。明確該通路的作用和機制的同時，也為結核的干預提供指導。

［1］Tubo NJ，Jenkins MK．CD4+ T Cells：Guardians of the Phagosome．Clinical Microbiology Reviews 2014，27(2）：200－213．

［2］Flynn JL，Chan J．Immunology of tuberculosis．Annual review of immunology 2001，19(1）：93－129．

［3］Urdahl KB，Shafiani S，Ernst JD．Initiation and regulation of T－cell responses in tuberculosis．Mucosal Immunology 2011，4 (3）：288－293．

［4］Hamid O，Carvajal RD．Anti－programmed death－1 and antiprogrammed death－ligand 1 antibodies in cancer therapy．Expert Opin Biol Ther 2013，13(6）：847－861．

［5］Sakthivel P，Gereke M，Bruder D．Therapeutic Intervention in Cancerand Chronic ViralInfections： Antibody Mediated Manipulation of PD－1/PD－L1 Interaction．Reviews on Recent Clinical Trials 7，2012，7(1）：10－23．

［6］Akbari O，Stock P，Singh AK，et al．PD－L1 and PD－L2 modulate airway inflammation and iNKT－cell－dependent airway hyperreactivity in opposing directions．Mucosal Immunology 2009，3(1）：81－91．

［7］Loke P，Allison JP．PD－L1 and PD－L2 are differentially regulated by Th1 and Th2 cells．Proceedings of the National Academy of Sciences 2003，100(9）：5336－5341．

［8］Javier O．Jurado IBA，Virginia Pasquinelli，et al．Programmed Death(PD）－1：PD－Ligand 1/PD－Ligand 2 Pathway Inhibits T Cell Effector Functions during Human Tuberculosis．The Journal of Immunology 2008，181(1）：116－125．

［9］Singh A，Mohan A，Dey AB，et al．Inhibiting the Programmed Death 1 Pathway Rescues Mycobacterium tuberculosis－Specific Interferon－Producing T Cells From Apoptosis in Patients With Pulmonary Tuberculosis．Journal of Infectious Diseases 2013，208(4）：603－615．

［10］Sakai S，Kawamura I，Okazaki T，et al．PD－1－PD－L1 pathway impairs Th1 immune response in the late stage of infection with Mycobacterium bovis bacillus Calmette－Guerin．International Immunology 2010，22(12）：915－925．

［11］Khader S，Tousif S，Singh Y，et al．T Cells from Programmed Death－1 Deficient Mice Respond Poorly to Mycobacterium tuberculosis Infection．PLoS ONE 2011，6(5）：e19864．

［12］Jurado JO，Alvarez IB，Pasquinelli V，et al．Programmed death (PD）－1：PD－ligand 1/PD－ligand 2 pathway inhibits T cell effector functions during human tuberculosis．J Immunol 2008，181(1）：116－125．

［13］Zhu W，Bao R，F(xiàn)an X，et al．PD－L1 Blockade Attenuated Sepsis－Induced Liver Injury in a Mouse Cecal Ligation and Puncture Model．Mediators of Inflammation 2013，2013：1－7．

［14］Singh AK，Stock P，Akbari O．Role of PD－L1 and PD－L2 in allergic diseases and asthma．Allergy 2011，66(2）：155－162．

［15］McNab FW，Berry MP，Graham CM，et al：Programmed death ligand 1 is over－expressed by neutrophils in the blood of patients with active tuberculosis．European Journal of Immunology 2011，41(7）：1941－1947．

［16］Marzo E，Vilaplana C，Tapia G，et al．Damaging role of neutrophilicinfiltration in a mouse modelofprogressive tuberculosis．Tuberculosis 2014，94(1）：55－64．

［17］Ryoyo Ikebuchi SK，Tomohiro Okagawa，Kazumasa Yokoyama，et al．Blockade of bovine PD－1 increases T cell function and inhibits bovine leukemia virus expression in B cells in vitro．Veterinary Research 2013，44(59）：1－15．

［18］Bhatt K，Kim A，Kim A，et al．Equivalent functions for B7．1 and B7．2 costimulation in mediating host resistance to Mycobacterium tuberculosis．Cellular Immunology 2013，285(1－2）：69－75．

［19］Mendoza－Coronel E，Camacho－Sandoval R，Bonifaz LC，et al．PD－L2 induction on dendritic cells exposed to Mycobacterium avium downregulates BCG－specific T cell response．Tuberculosis 2011，91(1）：36－46．

［20］Ivana B．Alvarez VP，Javier O．Jurado，Eduardo Abbate，et al．Role Played by the Programmed Death－1– Programmed Death Ligand Pathway during Innate Immunity against Mycobacterium tuberculosis．The Journal of Infectious Diseases 2010，202(4）： 524–532．

［21］Sabine J．W?lfle JS，Holger Bartz，Aline Sa¨hr，et al．PD－L1 expression on tolerogenic APCs is controlled by STAT－3．Eur J Immunol，2011，41(2）：413–424．

［22］Elizabeth Mendoza－Coronela RC－S，Laura C．Bonifazb，Yolanda López－Vidala．PD－L2 induction on dendritic cells exposed to Mycobacterium avium downregulates BCG－specific T cell response．Tuberculosis 2011，91(1）：36－46．

The immune role of PD-1：PD-L1/PD-L2 pathway in Mycobacterium tuberculosis infection

ZHAN Ling－jun，TANG Jun，QIN Chuan
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health;Key Laboratory of Human Diseases Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences，Pan Jia Yuan Nan Li No．5，Chao Yang District，Beijing 100021，China）

PD－1：PD－L1/PD－L2 pathway played negative immune role in most tumor and several infectious diseases，but the immune role in tuberculosis(TB）was not explicited．Since the high expression of PD－1：PD－L1/PD－L2 pathway was correlated with MTB infection both in vitro and in vivo，the in vitro negative immune role was indicated by inhibited T cell protective immune function，while the in vivo immune role was not clear．The binding of PD－1 and PD－L1 played an immunosuppression role，the expression of PD－L1 was regulated by Th1－type cytokines．The binding of PD－1 and PD－L2 played protective immune role，and the expression was regulated by Th1－type cytokines．The immune role and mechanism of PD－1，PD－L1 and PD－L2 would be investigated by Cas9－CRISPR technique，which would provide theoretical basis for the tuberculosis prevention and control．

PD－1：PD－L1/PD－L2 pathway;Mycobacterium tuberculosis infection;Immune role

R－332

A

1671－7856(2015）07－0074－03

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．016

“十二五－艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”國家科技重大專項子課題(2012ZX10004501）。

占玲俊，博士，副研究員，研究方向：結核病與結核動物模型研究。

秦川，教授，博士生導師。E－mail：chuanqin@vip．sina．com。

2015－06－24