劉 琴，王麗平，陳 芳，張 宜

(解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，武漢 430070）

脂肪干細(xì)胞分離純化方法研究進(jìn)展

劉 琴，王麗平，陳 芳，張 宜

(解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，武漢 430070）

脂肪干細(xì)胞作為種子細(xì)胞廣泛應(yīng)用于組織工程中，而獲得足夠量的、活性高的、高純度的脂肪干細(xì)胞是其在組織工程中應(yīng)用的前提。本文綜述近幾年來脂肪干細(xì)胞分離純化方法的研究進(jìn)展，比較各方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為分離純化出理想的脂肪干細(xì)胞提供理論依據(jù)。

脂肪干細(xì)胞;分離;純化;組織塊貼壁法;酶消化法;免疫磁珠分選法;密度梯度離心法

脂肪干細(xì)胞(adipose－derived stem cells）來源于脂肪組織，取材方便、對自體損傷較小，具有自我更新、多向分化能力、自體移植不發(fā)生排斥反應(yīng)等特點(diǎn)，是組織工程中最有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞之一。然而有研究表明，脂肪組織中存在的脂肪干細(xì)胞含量很低，占3%左右，并且分離出來的細(xì)胞純度不理想［1］。因此如何獲得足夠量的、活性高的、高純度的細(xì)胞極為重要。隨著科研技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者提出了脂肪干細(xì)胞不同的分離純化方法。本文就近年來脂肪干細(xì)胞分離純化方法的新研究進(jìn)展作一綜述。

1 脂肪干細(xì)胞分離方法

1.1 組織塊貼壁法

組織塊貼壁法即將脂肪組織剪成適宜大小的組織塊，然后將組織塊貼壁到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)［2］。此法的核心是確保脂肪組織塊貼壁，但在實(shí)際操作中很難保證每塊組織塊貼壁，尤其是在換液過程中，組織塊很容易漂浮，導(dǎo)致脂肪組織的浪費(fèi)。

Jing W等人［3］采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)8周齡BALB/c小鼠脂肪干細(xì)胞時(shí)，在脂肪組織剪碎之前，先吸取脂肪組織表面附著的多余水分，將脂肪組織塊接種到培養(yǎng)瓶后讓組織塊貼壁一段時(shí)間后再加入細(xì)胞培養(yǎng)液，這樣的處理可以使脂肪組織塊更加牢固地貼在培養(yǎng)瓶上。本實(shí)驗(yàn)室采用此法分離脂肪干細(xì)胞時(shí)將組織塊接種到培養(yǎng)瓶后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min后再加入培養(yǎng)液，使得組織塊貼壁更加牢固［4］。

1.2 酶消化法

酶消化法為原代細(xì)胞培養(yǎng)常用的方法之一，原理是利用新鮮離體組織的細(xì)胞生物學(xué)特性未發(fā)生明顯的變化，仍具有二倍體遺傳特性，通過消化液去除細(xì)胞間質(zhì)，使細(xì)胞能夠更好地吸收外界營養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物，短時(shí)間內(nèi)獲得大量的活細(xì)胞。脂肪組織酶消化法即脂肪組織被剪成碎塊置于酶中消化，再通過過濾、洗滌和離心等步驟去除漂浮在上層的脂肪細(xì)胞和油脂，從而得到脂肪干細(xì)胞。Jiang A等［5］通過酶消化法從人脂肪組織中分離出脂肪干細(xì)胞，所培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁生長、細(xì)胞形態(tài)為典型的長梭形成纖維樣，表達(dá)脂肪干細(xì)胞特殊的表面標(biāo)記物CD29、CD44、CD105，陰性表達(dá)造血干細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)記物CD34、CD45。

酶消化法實(shí)際上是一種費(fèi)時(shí)、昂貴的方法，尤其是在需要分離大量脂肪組織的時(shí)候，其弊端顯得更為突出;在酶的種類、濃度、消化時(shí)間上存在很大差異，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，大多數(shù)研究者采用Ⅰ型膠原酶消化分離原代細(xì)胞［6］，少數(shù)采用Ⅱ型膠原酶［7］、IV型膠原酶、VIII型膠原酶［8］、胰酶［9］或者膠原酶聯(lián)合應(yīng)用胰酶［10］進(jìn)行消化分離，酶的使用濃度從0．05～2．5 g/L不等［11－14］，消化時(shí)間范圍為0．5～3 h［15－17］，從而使得分離出來細(xì)胞的活性、表型、潛能存在一定的差異;另一方面，市場上的膠原酶和胰酶純度不高，可能包含有色素、內(nèi)毒素、異種抗原、異種蛋白酶體［18－19］;消化法獲得的脂肪干細(xì)胞不純;人為操作過多，容易造成污染;此外，需要的脂肪組織量較大，當(dāng)脂肪組織量較少時(shí)，采用此法無法擴(kuò)增出足夠量的脂肪干細(xì)胞用于后續(xù)分析［20］。

Griesche N等［21］在常規(guī)膠原酶消化法分離脂肪干細(xì)胞的基礎(chǔ)上作了一些改進(jìn)，在消化獲得的細(xì)胞接種培養(yǎng)60 min后馬上進(jìn)行換液，與常規(guī)膠原酶消化法相比，此法可以明顯減少desmin、smA和 six2的表達(dá)，提高干細(xì)胞標(biāo)記物nestin、oct－4和sall－1的表達(dá)。Carvalho PP等［22］使用臨床級的無異源蛋白的釋放酶消化人脂肪組織，消化獲得的脂肪干細(xì)胞活性和功能與使用科研級的膠原酶Ⅰ、膠原酶A、膠原酶NB4相比無明顯區(qū)別，表明高度純化的釋放酶可替代科研級的膠原酶，減少酶中異源蛋白對脂肪干細(xì)胞的污染。Güven S等［23］使用sepax裝置自動分離脂肪干細(xì)胞，方法是將樣品和膠原酶裝入轉(zhuǎn)移袋中，37℃孵育1 h后，轉(zhuǎn)移袋與CS－490．1試劑盒相接，在sepax裝置中啟動CS－490．1試劑盒開始自動消化，收集消化所得細(xì)胞，此裝置分離得到的脂肪干細(xì)胞比傳統(tǒng)的手動消化法效率高、細(xì)胞產(chǎn)量高、人為干預(yù)少。胡金靈等［24］分離SD大鼠脂肪干細(xì)胞時(shí)采用 0．25%Ⅰ型膠原酶消化脂肪組織30 min，離心，將獲得的細(xì)胞接種培養(yǎng)獲得所需的細(xì)胞，此法提高了膠原酶濃度，縮短消化時(shí)間，可減少膠原酶對細(xì)胞活性的影響;省略了傳統(tǒng)膠原酶消化法中篩網(wǎng)過濾和紅細(xì)胞裂解兩個(gè)步驟，降低人為操作、試劑對脂肪干細(xì)胞的損傷。

1.3 其他方法

近幾年來，除了傳統(tǒng)的脂肪干細(xì)胞分離方法，還有些尋求突破的新方法出現(xiàn)。

1．3．1 吸附柱法

Ito K等［25］于2010年首次使用由非織造織物組成的裝置從骨髓中成功分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，分離出來的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表型標(biāo)記物，具有成脂成骨潛能。Doi K等［26］參照上述方法設(shè)計(jì)出一個(gè)由無紡纖維和聚乙烯織物組成的網(wǎng)格直徑為100 μm的吸附柱，此無紡纖維和聚乙烯織物對貼壁細(xì)胞具有親和力，具體方法是將抽脂產(chǎn)物的液體部分通過吸附柱，貼壁細(xì)胞吸附到吸附柱中，再通過逆行流沖洗出吸附柱中吸附的細(xì)胞，獲得的細(xì)胞接種培養(yǎng)，擴(kuò)大的細(xì)胞表達(dá)脂肪干細(xì)胞相關(guān)的表面標(biāo)記物，具有向脂肪細(xì)胞與成骨細(xì)胞分化的能力，成功從抽脂產(chǎn)物液體部分中分離出脂肪干細(xì)胞。此法可以避免酶的使用，但是僅適用于抽脂產(chǎn)物的液體部分，而且需要大量的樣品。

1．3．2 直接離心法

直接離心法的原理是通過離心收集吸脂時(shí)吸脂產(chǎn)物中混有的游離脂肪干細(xì)胞，將離心得到的脂肪干細(xì)胞接種培養(yǎng)。Shah FS等［27］將得到的吸脂產(chǎn)物用磷酸鹽緩沖液洗滌，離心，分別收集上層漂浮物和下層沉淀物，上層漂浮物加入磷酸鹽緩沖液再次洗滌，離心，此過程重復(fù)3～4次，將每次獲得的下層沉淀物接種到培養(yǎng)瓶則可獲得脂肪干細(xì)胞。此法僅適用于吸脂手術(shù)獲得的脂肪組織，并且需要大量的吸脂產(chǎn)物。

1．3．3 膠原酶消化法結(jié)合組織塊貼壁法

候曉琳等［28］分離C57BL/6J小鼠脂肪干細(xì)胞時(shí)將Ⅰ型膠原酶消化獲得的單細(xì)胞以及未消化完全的脂肪組織塊一起接種到培養(yǎng)皿中，8～9 d時(shí)細(xì)胞即鋪滿皿底。此法將膠原酶消化法與組織塊貼壁法兩種方法有機(jī)結(jié)合起來，在短時(shí)間內(nèi)適度消化降低膠原酶對細(xì)胞活力損傷，同時(shí)把剩余未消化的脂肪組織塊一起接種，可以充分利用脂肪組織。不足之處是此法未與單獨(dú)采用Ⅰ型膠原酶消化法、組織塊貼壁法所獲得的脂肪干細(xì)胞在細(xì)胞產(chǎn)量、活性、分化潛能等方面進(jìn)行比較。

2 脂肪干細(xì)胞純化方法

為獲得純度較高的脂肪干細(xì)胞，目前有學(xué)者在分離的基礎(chǔ)上結(jié)合相應(yīng)的純化方法，以獲得研究需要的細(xì)胞，現(xiàn)有的脂肪干細(xì)胞純化方法如下。

2.1 免疫磁珠分選法

免疫磁珠分選法分離純化細(xì)胞的原理是基于細(xì)胞表面抗原與連在磁珠上相應(yīng)的特異性單抗結(jié)合，當(dāng)單細(xì)胞懸液通過特定的外加磁場時(shí)，與磁珠相結(jié)合的細(xì)胞被吸附滯留在磁場中，未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞則不能被吸附在分選柱內(nèi)，從而使細(xì)胞得以分離。免疫磁珠分選法將細(xì)胞生物學(xué)、磁力學(xué)和免疫學(xué)等知識融于一體，具有高度特異性分選細(xì)胞的特點(diǎn)。Gierloff M等［29］使用免疫磁珠分離法從培養(yǎng)的大鼠脂肪干細(xì)胞中分離純化出CD29+、CD71+、CD73+、CD90+各脂肪干細(xì)胞亞群，各干細(xì)胞亞群均具向脂肪細(xì)胞分化的能力，但是CD29+干細(xì)胞亞群的成脂能力強(qiáng)于CD71+、CD73+、CD90+各干細(xì)胞亞群。

免疫磁珠分選法純化脂肪干細(xì)胞順利進(jìn)行的重點(diǎn)側(cè)重于標(biāo)記磁珠時(shí)相應(yīng)抗體的選擇，若只用單一特異性標(biāo)記物原則上會造成其他脂肪干細(xì)胞亞群的丟失。目前有報(bào)道用 CD29、CD44、CD49d、CD73、CD105等作為純化脂肪干細(xì)胞的表面標(biāo)記物［30］。然而，至今為止研究者們對于脂肪干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物還存在一定的爭議，尤其是CD34。2006年國際細(xì)胞治療協(xié)會規(guī)定CD34為脂肪干細(xì)胞的陰性標(biāo)記物［31］。隨后許多研究者也同樣認(rèn)為脂肪干細(xì)胞不表達(dá)CD34。最近幾年，越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)早期培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞表達(dá) CD34［32－35］。Baer PC［36］認(rèn)為脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞表型在體外是動態(tài)的，隨著傳代次數(shù)的增多有的細(xì)胞表型消失，有的細(xì)胞表型增加。故采用免疫磁珠法純化脂肪干細(xì)胞時(shí)選擇的抗體和細(xì)胞傳代次數(shù)很重要。此外，常用的免疫磁珠分選法如親和吸附柱、FACS組織培養(yǎng)瓶鋪展貼壁、MACS都存在一些不足之處，如實(shí)驗(yàn)設(shè)備昂貴、試驗(yàn)成本高、技術(shù)要求高、分離出來的細(xì)胞容易污染、對細(xì)胞活力有一定的損傷等。重要的是分離出來的細(xì)胞仍然具有人工修飾的非自身的lg片段，進(jìn)行細(xì)胞移植治療時(shí)可能會引發(fā)一系列宿主反應(yīng)，尤其是會產(chǎn)生活性氧，活性氧進(jìn)一步引起炎癥反應(yīng)，同時(shí)影響脂肪干細(xì)胞自身的修復(fù)能力［37］。

2.2 密度梯度離心法

密度梯度離心法是根據(jù)不同顆粒之間的沉降系數(shù)不同，在一定離心力作用下，不同顆粒以自己的速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶，從而不同密度的細(xì)胞得到分離。杜明昌等［38］采用密度梯度離心法分離由真空負(fù)壓抽脂法吸取的豬皮下脂肪50 g，可獲得(2．1～2．7）×106個(gè)脂肪干細(xì)胞。

密度梯度離心法能夠順利進(jìn)行在于介質(zhì)的選擇和介質(zhì)最佳密度的確定上，目前常用的離心介質(zhì)為聚蔗糖(Ficoll）和經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆?；鞈乙?Percoll）。Chang等［39］研究發(fā)現(xiàn)利用Ficoll分離純化出來的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成核細(xì)胞數(shù)目及集落形成率均高于Percoll法，且Ficoll法純化出來的細(xì)胞顯著高表達(dá) CD90+、CD105+、CD166+和SH3+，認(rèn)為Ficoll更適用于制備人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。Bourzac等［40］的研究表明采用Percoll法分離純化馬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)量及自我更新潛能優(yōu)于 Ficoll法。Grisendi等［41］用1．073 g/mL、1．077 g/mL兩種不同密度的Ficoll分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果顯示，前者所得細(xì)胞在免疫熒光表達(dá)實(shí)驗(yàn)中更具有活力，成纖維細(xì)胞集落形成單位高出后者1．5倍，細(xì)胞產(chǎn)量高出后者1．8倍。上述研究表明使用不同介質(zhì)、不同密度的同一種介質(zhì)體外分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)對細(xì)胞的活性、產(chǎn)量、表型有著不同程度的影響，然而密度梯度離心常用介質(zhì)是否對脂肪干細(xì)胞的各方面存在影響還不得而知。

3 小結(jié)

尋找一種操作簡單、可控性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)的脂肪干細(xì)胞分離方法一直是學(xué)者們研究的重要內(nèi)容?，F(xiàn)有脂肪干細(xì)胞的分離方法種類較多，都存在一些缺點(diǎn)。組織塊貼壁法在操作中保證脂肪組織塊牢固貼壁是一個(gè)難題。酶消化法需要在酶的種類、濃度、消化時(shí)間上制定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。有研究表明采用組織塊貼壁法分離出來的脂肪干細(xì)胞產(chǎn)量高于酶消化法，所得細(xì)胞活性、細(xì)胞表型、成脂成骨分化能力與酶消化法相比無明顯區(qū)別［3，20］。若能解決組織塊貼壁法組織塊貼壁難的問題，那么組織塊貼壁法將是一種前景可觀的脂肪干細(xì)胞分離方法，因?yàn)榻M織塊貼壁法既可避免酶的使用對細(xì)胞各方面造成的潛在影響，又具有經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、可控性比酶消化法強(qiáng)的特點(diǎn)。其他脂肪干細(xì)胞的分離方法雖然在一定程度上可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的一些缺點(diǎn)，但是仍然不能解決現(xiàn)有脂肪干細(xì)胞分離方法存在的不足。要獲得高純度的脂肪干細(xì)胞，緊接細(xì)胞分離后即可進(jìn)行細(xì)胞純化，免疫磁珠分選法所使用的設(shè)備和抗體比較昂貴，不適用于一般的科研試驗(yàn)和臨床研究。密度梯度離心法所使用的試劑和設(shè)備比免疫磁珠分選法所采用的試劑和設(shè)備相對來說便宜很多，而且分離出來的脂肪干細(xì)胞純度較高，若能弄清楚離心介質(zhì)是否對脂肪干細(xì)胞各方面造成影響，則密度梯度離心法將是比較理想的脂肪干細(xì)胞純化方法。

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Progress in the isolation and purification methods of adipose-derived stem cells

LIU Qin，WANG Li－ping，CHEN Fang，ZHANG Yi
(Department of Medical Experiments，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command，Wuhan 430070，China）

Adipose－derived stem cells(ASCs）as potential seeded cells have been widely used in tissue engineering．Thus to obtain enough，high activity，high purity adipose－derived stem cells is the particular important premise of the application in tissue engineering．In this paper，the isolation and purification methods of ASCs were reviewed and the merit and demerit of different methods were compared in order to provide theoretical basis for safe and high－effective isolation and purification of ASCs．

Adipose－derived stem cells;Isolation;Purification;Explants culture method;Enzymatic digestion method;Immunomagnetic beads sorting method;Density gradient centrifugation

R－332

A

1671－7856(2015）07－0069－05

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．015

劉琴(1986－），女，技師，碩士，從事細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方面的研究，E－mail：liuqin_0629@163．com

張宜(1965－），男，碩士，主任藥師，從事藥學(xué)信息研究，E－mail：abcd1566@sina．com

2015－06－10