王飛，李建國，吳巧斌，鄧龍，羅杰，李再曄

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院普一科，福建 漳州 363000；2.福建省漳州正興醫(yī)院肝膽胰脾診療中心，福建 漳州 363000；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013）

·論著·

P21活化激酶6在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其意義

王飛1，李建國2，吳巧斌1，鄧龍1，羅杰1，李再曄3

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院普一科，福建 漳州 363000；2.福建省漳州正興醫(yī)院肝膽胰脾診療中心，福建 漳州 363000；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013）

目的探討P21活化激酶6（PAK6）在結(jié)腸癌組織的表達(dá)水平及臨床意義。方法應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time PCR/qPCR）檢測25例結(jié)腸癌患者腫瘤組織、配對的癌旁正常組織PAK6基因的mRNA表達(dá)水平，通過免疫組織化學(xué)的方法檢測94例結(jié)腸癌及其癌旁正常組織PAK6的蛋白表達(dá)水平，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果qPCR顯示腫瘤組織中PAK6 mRNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.01）。免疫組織化學(xué)顯示PAK6在正常組織低表達(dá)10.64%（10/94），在腫瘤組織中高表達(dá)64.89%（61/94）；PAK6的表達(dá)量與腫瘤AJCC分期、腫瘤分化、Ki67表達(dá)水平和腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析顯示PAK6陽性組患者5年無病生存率及總體生存率均明顯低于PAK6陰性組（P＜0.01）；多因素COX回歸模型分析發(fā)現(xiàn)PAK6高表達(dá)是影響結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)的獨立危險因素。結(jié)論PAK6在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，與腫瘤分期、分化及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為結(jié)腸癌預(yù)后判斷的指標(biāo)。

結(jié)腸癌；PAK6；預(yù)后

P21活化激酶（p21-activated kinases，PAKs）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為P21活化激酶的6個家族成員之一，可通過下游眾多的激酶底物和結(jié)合蛋白參與眾多的生物學(xué)功能，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等方面起重要作用[1-2]。最近研究發(fā)現(xiàn)P21活化激酶6（p21-activated kinase 6，PAK6）在肝癌和前列腺癌組織中高表達(dá)[3-4]，但是目前尚缺乏PAK6在結(jié)腸癌組織中的研究。本實驗旨在觀察PAK6表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床特點及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1一般資料

隨機(jī)抽取2007年1月-2010年12月福建省漳州市醫(yī)院普外科手術(shù)臘塊標(biāo)本庫中94例結(jié)腸癌患者的癌組織和相應(yīng)的正常結(jié)腸上皮組織。所有標(biāo)本收集術(shù)前均獲得患者同意并獲得福建省漳州市醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。94例結(jié)腸癌患者中，女51例（54.26%），男43例（45.74%）；年齡35～88歲（中位年齡61歲）。美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)分期Ⅰ期患者20例（21.28%），Ⅱ期患者30例（31.91%），Ⅲ期患者30例（31.91%），Ⅳ期患者14例（14.89%）。所有病例均達(dá)到肉眼下根治，并行術(shù)野的淋巴結(jié)清掃。所有病例術(shù)前均未行放、化療等抗腫瘤治療。隨訪間隔按照國際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)，為術(shù)后1～2年每3個月1次，第3年起每半年1次，第5年后每年1次。本研究隨訪截至?xí)r間為2014年6月1日。隨訪率為92.55%。

1.2RNA提取及cDNA合成

應(yīng)用Trizol試劑盒（BBI公司，加拿大）隨機(jī)抽取25對組織標(biāo)本抽提總RNA。用紫外分光光度計檢測RNA的濃度，根據(jù)在260和280 nm處的吸光度值，檢測RNA的純度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的質(zhì)量。采用Fermentas（加拿大Fermentas公司）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以O(shè)ligo（dT）15為引物，由total RNA的3’Poly（A）區(qū)域引導(dǎo)出cDNA，反應(yīng)條件：25℃5 min，42℃60 min，70℃5 min。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative PCR detecting system，qPCR）

以cDNA產(chǎn)物為模版，以β-actin為內(nèi)參，設(shè)計并合成聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)引物，依據(jù)SYBR Green qPCR Master Mix（加拿大Fermentas公司）進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。引物序列：PAK6，正向引物：5'-ATCTGGGAGAGAAGG CGAAC-3'；反向引物：5'-GGAGGACAAGGAGACAG CAG-3'；β-actin正向引物：5'-CTGGGACGACATGG AGAAAA-3'；反向引物:5'-AAGGAAGGCTGGAAGA GTGC-3'。qPCR反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)后72℃延伸5 min。反應(yīng)完成后，取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳[5]。

1.4免疫組織化學(xué)法

所有94對標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋、切片厚4～6μm，脫蠟，再水化。置于pH 6.0的檸檬酸緩沖液中行高壓抗原修復(fù)后，3%雙氧水（H2O2）封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。一抗孵育[PAK6，1∶300，美國Abcam；細(xì)胞核增殖抗原（Ki67），1∶500，美國Abcam]，4℃冰箱濕盒內(nèi)孵育過夜。滴加二抗（基因科技，GK500705），并置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min。顯微鏡下二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水至透明，中性樹膠封片。用已知結(jié)腸癌切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對照[6-7]。評分標(biāo)準(zhǔn)：著色強(qiáng)度評分（0分，無；1分，弱；2分，中；3分，強(qiáng)），免疫組化陽性細(xì)胞率評分（0分，＜5%；1分，5%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%），兩者之和為該病例評分值，設(shè)定評分0～2為陰性，＞2為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料組間差異比較采用配對t檢驗和方差分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗，單因素生存分析用Kaplan-Meier法，用COX比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1RNA抽提質(zhì)量鑒定

經(jīng)鑒定，最終所有樣本RNA在A260/A280的比值均在1.8～2.0，表明提取的RNA無明顯降解，達(dá)到所需純度。

2.2實時定量PCR（qPCR）

腸癌組織和癌旁組織中PAK6 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)腸癌組織中PAK6 mRNA明顯增高，具體情況見表1、圖1。

表1 結(jié)腸癌組織與癌旁組織PAK6 mRNA表達(dá)水平（±s）

組別例數(shù)PAK6 mRNA相對表達(dá)t值P值結(jié)腸癌組織250.4010±0.0784.0810.0006癌旁組織250.1190±0.027

2.3免疫組化結(jié)果

94例結(jié)腸癌腫瘤組織中PAK6陰性者33例，陽性者61例。PAK6在正常組織低表達(dá)10.64%（10/94），在腫瘤組織中高表達(dá)64.89%（61/94），與qPCR檢測結(jié)果一致。PAK6表達(dá)與臨床病理資料的聯(lián)系見表2。PAK6在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、AJCC分期及Ki67顯著相關(guān)（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤大小及腫瘤部位無顯著相關(guān)（P＞0.05）。見圖2。

2.4結(jié)腸癌組織中PAK6蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

94例結(jié)腸癌患者的5年總體生存率為52.2%。根據(jù)PAK6蛋白表達(dá)程度相應(yīng)地分成PAK6陽性組和PAK6陰性組，Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示PAK6陽性組結(jié)腸癌患者的5年無病生存率及5年總生存率分別為30.3%及33.9%，明顯低于PAK6陰性表達(dá)組的87.9%、84.8%，兩者間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=25.801，P＜0.01；χ2=20.807，P＜0.01，圖3）。在COX多因素回歸模型分析中，將患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化、AJCC分期、PAK6表達(dá)水平及Ki67表達(dá)水平納入其中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAK6蛋白表達(dá)是結(jié)腸癌患者無病生存率（P＜0.001）和總體生存率（P=0.003）的獨立預(yù)后因素（表3）。此外，AJCC分期和腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也是結(jié)腸癌的獨立預(yù)后因子（P＜0.001）。

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多階段的演變過程，小GTP蛋白酶Rho，Rac，Ras和Cdc42在一些重要的腫瘤中起作用[8]。PAKs作為Rac和Cdc42的效應(yīng)器，生物研究顯示其通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、生存、運動和血管生成等腫瘤標(biāo)記過程，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用[9]。PAKs包含6個亞型（PAK1-6），基因PAK6位于15q14，編碼75kDa的蛋白，含有能與Cdc42/Rac相互結(jié)合（CRID）的N端區(qū)域和C端激酶域，在哺乳動物多種癌癥中呈過表達(dá)、擴(kuò)增或高反應(yīng)狀態(tài)[10]。

自PAK6被發(fā)現(xiàn)以來，越來越多的研究集中于PAK6生物功能和作用機(jī)制。RNA印跡分析揭示PAK6在睪丸和前列腺組織中高表達(dá)[3]。PAK6可特異性直接抑制雄激素受體（androgen receptor，AR）的活性，進(jìn)而抑制AR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過程[11]。此外，PAK6還可增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞對多西他賽的化療敏感性及對放射線的敏感性[12-13]，據(jù)此推測PAK6在癌癥的發(fā)展和治療過程中可能起著重要作用。

該實驗是首個報道PAK6高表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究。為了解PAK6在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，筆者隨機(jī)抽取了25對結(jié)腸癌患者臨床標(biāo)本進(jìn)行qPCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAK6在腫瘤組織的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)腸癌組織（P＜0.01）。免疫組化顯示PAK6在94例結(jié)腸癌腫瘤組織中高表達(dá)64.89%（61/94），正常組織中只有10.64%（10/94）PAK6陽性。這些結(jié)果提示PAK在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平都是高表達(dá)，支持其作為新的結(jié)腸癌診斷的指標(biāo)。臨床資料統(tǒng)計進(jìn)一步分析顯示PAK6的表達(dá)量與腫瘤AJCC分期、腫瘤分化、Ki67表達(dá)量和腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，這些相關(guān)性提示PAK6高表達(dá)會促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步對94例結(jié)腸癌手術(shù)患者進(jìn)行Kaplan-Meier單因素生存分析，顯示PAK6陽性組患者5年無病生存率及總體生存率均明顯低于PAK6陰性組，其與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)；多因素COX回歸模型分析發(fā)現(xiàn)PAK6表達(dá)是影響結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)的獨立危險因素。

該研究結(jié)果初步揭示了PKA6蛋白的表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床病理及預(yù)后的關(guān)系，提示PAK6可有助于判斷結(jié)腸癌生存預(yù)后。由于樣本量有限，PAK6對結(jié)腸癌的診治意義有待于進(jìn)一步探討；相信，隨著臨床試驗和生物藥學(xué)研究的順利進(jìn)行，PAK6可能是監(jiān)測腫瘤臨床預(yù)后的有用指標(biāo)。

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Expression and clinical significance of p21-activated kinase 6 in colon cancer

Fei WANG1,Jian-guo LI2,Qiao-bin WU1,Long DENG1,Jie LUO1,Zai-ye LI3
(1.Department of General Surgery;2.Department of Hepatobiliary,Pancreas and Spleen Surgery, Zhengxing Hospital,Zhangzhou,Fujian 363000,P.R.China;3.Xiangya School of Medicine,Central South University,Changsha,Hunan 410013,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of p21-activated kinase 6 and its clinical significance in colon cancer.【Methods】Use reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)and quantitative real-time PCR(qPCR)to test the expression of PAK6 mRNA in 25 paired tissues of colon cancer,and use the method of immunohistochemistry to test the expression of PAK6 in 94 paired cancer tissues.【Results】The results of qPCR showed that the average expression value of PAK6 mRNA in colon cancer tissues is actually higher than the normal tissues(P＜0.01).Immunohistochemical detection of PAK6 among 94 paired specimens showed seldom expression in normal tissues which only occupies 10.64%,while it highly expressed among the cancer tissues which account for 64.89%.Increased PAK6 was significantly associated with advanced AJCC stage index,tumor histologic grade,Ki67 expression and distant metastasis(P＜0.05).Kaplan-Meier univariate survival analysis revealed that five-year disease-free survival and overall survival rate for patients with positive PAK6 expression were significantly lower than those with negative PAK6 expression(P＜0.01).Multivariate Cox regression analysis revealed that PAK6 expression was an independent prognostic factor in disease-free survival and overall survival for patients with colon cancer.【Conclusion】The expression of PAK6 in colon cancer is significantly increased,it is probably a prognostic marker for colon cancer.

colon cancer;PAK6;prognosis

R737.14

A

1005-8982（2015）28-0007-05

2015-05-10

李建國，E-mail：jjxln649@163.com