陳凱男，李充璧

(1.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 0 10021;2.肇慶學(xué)院生物醫(yī)藥工程中心，廣東肇慶 5 26061)

柑橘黃龍病是柑橘種植業(yè)中的一種毀滅性病害，又稱青果病、枯黃病、黃梢病。主要通過(guò)柑橘帶菌種苗、帶菌接穗或帶菌柑橘木虱形成病原菌源，然后在柑橘枝條抽發(fā)時(shí)期進(jìn)行大面積傳播，繼而對(duì)柑橘生產(chǎn)造成重大災(zāi)害。有文史記載，柑橘黃龍病發(fā)生由來(lái)已久，早在百年之前，已經(jīng)初步形成災(zāi)害，盡管目前柑橘黃龍病的研究較多，但仍然無(wú)法全面根治。本文介紹了近年來(lái)柑橘黃龍病研究取得的進(jìn)展，以期為柑橘黃龍病研究工作提供參考。

1 柑橘黃龍病的危害

1919年，在華南地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍?。?］。目前為止，中國(guó)19個(gè)栽培柑橘的省區(qū)已經(jīng)有11個(gè)遭受過(guò)柑橘黃龍病危害，受災(zāi)面積已達(dá)總面積的80%，損失產(chǎn)量占總產(chǎn)量的85%左右。2004年和2005年巴西圣保羅州、佛羅里達(dá)州分別發(fā)生了柑橘黃龍病災(zāi)害［2］，給柑橘種植者造成了極大損失。除去地中海盆地、太平洋島嶼、澳洲和西亞之外，亞洲、非洲、大洋洲、美洲的40多個(gè)國(guó)家都相繼發(fā)生過(guò)柑橘黃龍病災(zāi)害［3］。此病存在潛伏期，通常新植株染病后不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)，但1～2年植株會(huì)死亡，老齡植株抵抗力相對(duì)較強(qiáng)，會(huì)在3～5年死亡，嚴(yán)重時(shí)經(jīng)常造成全園感染，損失重大。柑橘黃龍病破壞力巨大，目前還沒(méi)有根治此病的方法，所以柑橘黃龍病被稱作柑橘中的癌癥。

2 柑橘黃龍病的癥狀

患病植株初期葉片呈斑駁狀或黃化型，后期出現(xiàn)類似缺鋅的癥狀，整體黃化甚至枯萎?；疾≈仓觊_(kāi)花早，結(jié)果率低，產(chǎn)量銳減，所結(jié)果實(shí)小，顏色不正常，俗稱“紅鼻果”或“斜肩果”，品質(zhì)較差。夏梢和秋梢比春梢較易發(fā)病，果實(shí)上面部分呈黃色，下面部分呈綠色。通過(guò)觀察染病植株葉片的亞顯微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化。如葉綠體中淀粉粒膨大;基粒受到不同程度的破壞，呈松散狀，排列比較紊亂;細(xì)胞膜凹陷形成質(zhì)膜體，內(nèi)部有許多形態(tài)不一的空泡;線粒體內(nèi)嵴也被破壞，有的斷裂不完整，有的已經(jīng)消失［4］。

3 柑橘黃龍病的研究概況

3.1 病原研究

最初對(duì)柑橘黃龍病的種種推測(cè)及猜測(cè)都缺乏科學(xué)依據(jù)，直到出現(xiàn)病芽嫁接的相關(guān)報(bào)道，才發(fā)現(xiàn)該病由病毒傳播引發(fā)。Doi等［5］首次在植物中發(fā)現(xiàn)了類菌原體病原，而Laflche等［6-7］通過(guò)用電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)南非青果病和印度枯梢病等病株篩管的組織中也存在類菌原體，因此推測(cè)柑橘黃龍病的病源是類菌原體。然后在中國(guó)臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)的立枯病和菲律賓地區(qū)感染的葉斑駁病植株體內(nèi)同樣觀察到了類菌原體。因?yàn)檫@種病原體的膜有3層結(jié)構(gòu)，膜的厚度大概有20 nm，比類菌原體的界限膜厚得多，因此又認(rèn)為，這種感染植物的病毒是一種未命名的病原菌［8］。Garnier等［9］研究發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病病原的膜結(jié)構(gòu)中，內(nèi)、外2層膜之間的肽聚糖與革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)十分相似，推測(cè)柑橘黃龍病的病原菌屬于革蘭氏陰性菌，屬于變形菌門的α亞群，病原為Proteobacteria綱，韌皮部桿菌屬，其形態(tài)與螺原體及菌原體不同。根據(jù)菌體的熱敏感性，可分為亞洲型 (Candidatus Liberibacter asiaticus)、美洲型 (Ca．L.amercanus)、非 洲 型 (Ca．L.africanus)。柑橘黃龍病病菌很難進(jìn)行人工培養(yǎng)。據(jù)報(bào)道，國(guó)內(nèi)外均有柑橘黃龍病病菌培養(yǎng)成功的案例，但均被后來(lái)研究推翻，認(rèn)為是假培養(yǎng)。

3.2 病原的檢測(cè)方法

3.2.1 田間診斷

肉眼觀察黃化現(xiàn)象，將發(fā)病植株枝條剪去，保證肥力、水分充足，外界條件正常，待新枝條長(zhǎng)出，看是否存在黃化現(xiàn)象，如果存在，則證明染病，反之則沒(méi)有。還可以使用指示植物，如椪柑。通過(guò)嫁接的方法將枝條接到指示苗木枝干上，每次接20株，21～23℃溫室培養(yǎng)，大概3～4個(gè)月即可表現(xiàn)出癥狀。田間診斷法相對(duì)簡(jiǎn)單、快捷，成本小，具有多年應(yīng)用歷史，是目前應(yīng)用最廣泛的方法。因?yàn)橹仓耆~片黃化有多種原因，所以僅靠觀察黃化現(xiàn)象并不準(zhǔn)確。

3.2.2 電鏡觀察法

在電子顯微鏡下觀察，可以看到病菌的大小、形狀及膜結(jié)構(gòu)。但由于病菌分布不均勻以及采集方法不正確，通常檢測(cè)準(zhǔn)確度不高。

3.2.3 血清學(xué)鑒別法

此法需要抗體、抗原的結(jié)合，原理是依據(jù)抗體和抗原的高度特異性，由于抗體多在于血清中，所以被稱為血清學(xué)反應(yīng)。國(guó)內(nèi)外都已制成有單克隆抗體，但是由于單克隆抗體特異性較強(qiáng)，只能與相應(yīng)的抗原發(fā)生反應(yīng)，不能與大部分的抗原發(fā)生反應(yīng)，因此，該方法的應(yīng)用受到很大限制。

3.2.4 PCR檢測(cè)法

PCR技術(shù)高度靈敏，能檢出和擴(kuò)增任何僅含有一個(gè)DNA模板的樣品。PCR檢測(cè)法又分為4種，常規(guī)PCR、巢式PCR、定量PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR。1999年，Hocquellet等文獻(xiàn)對(duì)比In-2.6(M94319)和As-1.7(U09675)的rplKAJL-rpoBC基因序列設(shè)計(jì)出引物對(duì)A2和J5，分別在2種病菌中擴(kuò)增出不同的片段。李韜等發(fā)現(xiàn)巢式PCR可以檢測(cè)到單頭帶菌木虱。2004年，張利平［10］運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)柑橘黃龍病病菌，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)精準(zhǔn)度是常規(guī)PCR的100倍。

3.2.5 淀粉-碘反應(yīng)檢測(cè)

2002年，Masatoshi用組織學(xué)方法證實(shí)了感染黃龍病的柑橘葉片積累大量的淀粉粒。2002年，Onuk等［11］利用淀粉-碘反應(yīng)原理對(duì)柑橘黃龍病進(jìn)行了診斷。

3.2.6 高光譜檢測(cè)技術(shù)

高光譜檢測(cè)技術(shù)是應(yīng)用高光譜圖像進(jìn)行物質(zhì)成分檢測(cè)的技術(shù)。近年來(lái)，美國(guó)科學(xué)家將高光譜技術(shù)應(yīng)用到柑橘黃龍病的檢測(cè)領(lǐng)域，旨在尋找一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法［12］?？蒲腥藛T運(yùn)用熒光成像光譜分析技術(shù)對(duì)柑橘健康葉子與黃龍病葉子、健康葉子與腐爛葉子、健康葉子與非黃龍病但斑駁黃化葉子進(jìn)行檢測(cè)，辨識(shí)率分別達(dá)為89%，87%和87%［13］。美國(guó)國(guó)家機(jī)器人工程中心科學(xué)家找到了柑橘黃龍病葉的顯著光譜特征，樣本采樣數(shù)量足夠時(shí)，正確辨識(shí)率達(dá)95%以上［14］。美國(guó)農(nóng)業(yè)部科學(xué)家通過(guò)FT-IR-ATR法進(jìn)行檢測(cè)，正確辨識(shí)率達(dá)95%以上，并且成本低，速度快［15］。

3.3 病菌的防治

現(xiàn)代科技日益發(fā)達(dá)，對(duì)柑橘黃龍病的研究也日益加深，但目前對(duì)該病防治還沒(méi)有十分有效的方法，截?cái)嗖≡磦鞑ネ緩?、培育無(wú)毒種苗是普遍接受的方法。本文總結(jié)了比較實(shí)用、便捷的防治方法，介紹如下。

3.3.1 加強(qiáng)植株檢查和果園管理

要盡量避免發(fā)生病害，就需要從源頭截?cái)唷?yán)格審核每個(gè)環(huán)節(jié)，嚴(yán)禁從發(fā)病區(qū)進(jìn)行接種、換種以及育苗，也不能使攜帶有木虱的植株進(jìn)入非病區(qū);加強(qiáng)果園管理，增強(qiáng)樹(shù)勢(shì);減少農(nóng)藥化肥的使用，首選有機(jī)肥料和微生物肥料，給種苗提供一個(gè)適宜的環(huán)境，增強(qiáng)植株抵抗力。

3.3.2 培育無(wú)菌種苗

柑橘黃龍病之所以難以防治，并且為害嚴(yán)重，很大一部分原因是種苗本身帶毒，所以培育無(wú)菌種苗十分重要。無(wú)菌種苗培育方法又分為熱處理法、珠心胚法、莖尖培養(yǎng)法和莖尖微芽嫁接法。柑橘黃龍病病原具有熱敏感性，羅志達(dá)等［16］發(fā)現(xiàn)用含四環(huán)素的熱水處理帶病枝條比單獨(dú)用熱水處理效果好。高峰等［17］對(duì)華盛頓臍橙沒(méi)有受精的胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)，從發(fā)病植株中獲得無(wú)病毒珠心苗。陳青瑛等［18-19］利用莖尖培養(yǎng)法獲得無(wú)病毒柑橘植株。蔣元暉等［20-21］相繼采用微芽嫁接技術(shù)成功培育出無(wú)病毒柑橘植株，隨后，姜玲等［22］改進(jìn)了柑橘微芽嫁接技術(shù)，提高了生產(chǎn)率。

3.3.3 培育抗性種苗

因?yàn)楦涕冱S龍病防治工作頗為艱辛，有學(xué)者提出培育抗病植株，目前許多科研工作者在這方面做了大量研究工作，主要利用雜交技術(shù)、遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)、RGA基因克隆技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。Shinozaki等［23］將九里香和柑橘進(jìn)行體細(xì)胞雜交，但獲得的雜交苗畸形，生長(zhǎng)緩慢;美國(guó)農(nóng)業(yè)部柑橘育種中心已經(jīng)培育出具有一定抗性的植株［24］。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗菌肽基因?qū)敫涕?，從而培育出抗病植株。Grosser等［25］將抗菌肽基因轉(zhuǎn)入甜橙和柚子，16個(gè)月后，植株仍未出現(xiàn)病癥。RGA基因克隆技術(shù)是目前的研究熱點(diǎn)，但是R基因以基因簇形式存在，還難以確定目的R基因。轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組技術(shù)方面也做了大量研究，Martinelli等［26］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)黃龍病調(diào)控基因參與糖代謝、光合作用、細(xì)胞壁、植物激素、細(xì)胞揮發(fā)性物質(zhì)合成等過(guò)程，熱激蛋白表達(dá)水平的改變對(duì)柑橘黃龍病起到至關(guān)重要的作用。總之，目前抗性育種方面還不太成熟，還需要深入研究。

4 展望

從發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病至今，對(duì)柑橘黃龍病的研究一直沒(méi)有停止過(guò)。因?yàn)槿狈股胤矫娴乃幬?，目前主要以預(yù)防為主，仍然不能根治此病［27］。對(duì)發(fā)病植株最常用的方法仍然是鏟除病樹(shù)或者剪掉病枝，這對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)造成了很大的損失。最合理的方法是加強(qiáng)果園管理［28］，消滅柑橘木虱，及時(shí)挖除病樹(shù)，培育無(wú)毒苗，盡早培育出抗性植株［29］。對(duì)科研工作者而言，首先應(yīng)該獲得病菌的純培養(yǎng)，不能純培養(yǎng)對(duì)柑橘黃龍病的研究造成了重大的阻礙［30］;其次應(yīng)該從分子生物學(xué)方面著手，培育抗性柑橘品種。

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