康桂英

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028000)

口蹄疫診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

康桂英

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028000)

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，被世界衛(wèi)生組織列為A類傳染病。由于該病傳播迅速、難以防治，所以，準(zhǔn)確而快速的診斷技術(shù)成為防治該病的必要措施。目前，口蹄疫的檢測(cè)技術(shù)主要有病毒培養(yǎng)與鑒定、血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等。

1 病毒培養(yǎng)與鑒定

首先，從患病家畜無(wú)菌采集病料，做病原體的分離培養(yǎng)與鑒定。將提取物在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，然后，根據(jù)培養(yǎng)物的特性做出診斷。到目前為止，從病料中分離提取病原體是檢測(cè)口蹄疫最可靠的方法。

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

口蹄疫病毒的分離培養(yǎng)最初采用單層初代豬腎細(xì)胞，隨著培養(yǎng)系統(tǒng)的完善和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的創(chuàng)新，發(fā)現(xiàn)了許多新的培養(yǎng)口蹄疫病毒的細(xì)胞，常見的有初代小牛甲狀腺細(xì)胞、小牛腎細(xì)胞、乳倉(cāng)鼠細(xì)胞等。楊永欽等用BHK-21細(xì)胞來(lái)傳代培養(yǎng)兔毒O型兩個(gè)毒株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)少量毒株在116代后可觀察到點(diǎn)狀細(xì)胞脫落、隨著傳代次數(shù)增加細(xì)胞病變嚴(yán)重。在對(duì)于AsiaⅠ兔化毒在BHK-21細(xì)胞傳代培養(yǎng)在22代時(shí)就出現(xiàn)細(xì)胞脫落。王光祥等用仔豬心肌原代細(xì)胞對(duì)口蹄疫病毒進(jìn)行培養(yǎng)，然后再用ELISA檢測(cè)方法對(duì)所培養(yǎng)的病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)前后病毒完全一樣。

1.2 動(dòng)物接種

目前，用于口蹄疫病毒鑒定的動(dòng)物有：乳鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、乳兔、雞胚，以乳鼠、豚鼠最常用。從病料中將病原體分離提取后，接種于2～7日齡乳小鼠，在24h左右觀察小鼠變化，結(jié)果小鼠行動(dòng)不便，四肢僵直，呼吸急促，最終導(dǎo)致小鼠死亡。豚鼠也經(jīng)常作為口蹄疫實(shí)驗(yàn)感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將口蹄疫病毒于豚鼠腿部的皮膚或在頸部皮內(nèi)接種，第二日在接種部位可見到水泡，隨后水泡慢慢消失，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)糜爛面，但是在口腔中發(fā)現(xiàn)水泡。

2 血清學(xué)診斷

2.1 凝集抑制試驗(yàn)

有些病毒具有凝集某種動(dòng)物紅細(xì)胞的能力，稱為病毒的血凝，利用這種特性設(shè)計(jì)的試驗(yàn)稱血球凝集試驗(yàn)，通過(guò)血凝與血凝抑制試驗(yàn)，可用已知血清來(lái)鑒定未知病毒，也可用已知病毒來(lái)檢查被檢血清中的抗體滴度。

2.1.1 正向間接血凝試驗(yàn)

該方法是指用滅活的口蹄疫病毒致敏綿羊紅細(xì)胞，然后用其檢測(cè)血清中抗體。曹旭[4]在內(nèi)蒙古地區(qū)提取分離出牛O型口蹄病毒，并且制備成高免血清，并采用綿羊紅細(xì)胞制成正向間接血凝液。利用制備的正向間接血凝液對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)?？谔阋呙庖哐暹M(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法能高效、快速檢測(cè)免疫血清抗體。趙明娟等[5]用正向間接血凝方法與液相阻斷ELISA方法對(duì)O型口蹄疫抗體合格率檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)正向間接血凝方法比液相阻斷ELISA方法使用設(shè)備少，操作簡(jiǎn)單，價(jià)廉。

2.1.2 反向間接血凝試驗(yàn)

該方法是用針對(duì)口蹄疫病毒的特異性抗體致敏紅細(xì)胞，然后用其檢測(cè)樣品中的口蹄疫病毒。李世軍將口蹄疫病毒在BHK-21細(xì)胞分離培養(yǎng)后，并用豬O型口蹄疫病毒IgG抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記，最后采用反向間接血凝試驗(yàn)成功檢測(cè)出病毒所在位置。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA作為一種新的診斷方法在近些年來(lái)得到飛速發(fā)展，經(jīng)過(guò)許多研究者多年的努力，現(xiàn)已形成液相阻斷ELISA、固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA以及間接夾心ELISA等多種ELISA診斷方法。

2.2.1 液相阻斷ELISA

Hamblin等用液相ELISA方法與VNT對(duì)口蹄疫抗體檢測(cè)比較試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于病毒在液相狀態(tài)下其抗原處于自然狀態(tài)可以和血清更好的反應(yīng)。所以，不用特定培養(yǎng)分離病毒比VNT更加安全、快捷，使得對(duì)于口蹄疫的診斷環(huán)境要求更加簡(jiǎn)便。在2005年，馬軍武等首次用液相阻斷ELISA檢測(cè)AsiaⅠ型口蹄疫。液相阻斷ELISA可以快捷、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)出血清中抗體含量。該方法在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用將ELISA推上了一個(gè)新階段。

2.2.2 固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA

固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)口蹄疫血清中抗體與液相阻斷ELISA相比較其敏感性相似。2008 年林密[9]等建立了O型口蹄疫病毒固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA 抗體檢測(cè)方法，并用該方法對(duì)92份非口蹄疫區(qū)無(wú)免疫牛血清進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)血清抗體效價(jià)均低于1.32。由此，確立了判斷O型口蹄疫血清抗體效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)值是大于或等于1.32。在與液相阻斷ELISA相比較試驗(yàn)，得出固相競(jìng)爭(zhēng)ELIA特異性要比液相阻斷ELISA特異性高10.8%。

3 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

該方法是指在特定的條件下，以被檢病料中少量的病原遺傳物質(zhì)為模版，在體外迅速擴(kuò)增該遺傳物質(zhì)的過(guò)程。該方法具有靈敏度高、省時(shí)、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，所以該方法被廣泛用于口蹄疫的診斷。在1999年，我國(guó)科學(xué)家吳時(shí)友等[10]用PCR反應(yīng)擴(kuò)增110bp寡聚核酸片段，并由光敏生物素標(biāo)記和TdT催化進(jìn)行的3＇末端標(biāo)記而成的寡聚核苷酸探針，在經(jīng)過(guò)NC膜上斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)可以檢測(cè)出患病死亡動(dòng)物體內(nèi)的口蹄疫病毒。在1996年，朱彩珠[11]等用BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)口蹄疫病毒、乳鼠傳代口蹄疫病毒、豬水泡皮和牛舌皮等作為病毒材料，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）技術(shù)快速、簡(jiǎn)捷的檢測(cè)出牛O-P液中的口蹄疫病毒，在與常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)相比較試驗(yàn)中，RT-PCR比常規(guī)檢測(cè)技術(shù)靈敏度提高了12倍左右。到2005年，包慧芳等[12]在口蹄疫病毒3D基因區(qū)設(shè)計(jì)一組特異的引物和探針并對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記實(shí)時(shí)定量RTPCR，可以快速檢測(cè)口蹄疫病毒，且可對(duì)病毒進(jìn)行定量檢測(cè)，具有高度的特異性和實(shí)時(shí)性。這種定時(shí)定量的方法進(jìn)一步完善和推動(dòng)了PCR技術(shù)在FMDV檢測(cè)中的應(yīng)用。

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康桂英（1976-），女，內(nèi)蒙古涼城人，碩士，主要從事寄生蟲及寄生蟲病的研究。

項(xiàng)目來(lái)源：內(nèi)蒙古民族大學(xué)科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：NMD1215）