綜述與專論

小鼠局灶性腦中風模型研究進展

閆峰1，左瑋2，羅玉敏1

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院腦血管病研究室，北京100052； 2.中國醫(yī)學科學院藥物研究所，北京100050)

【摘要】中風是包括大腦缺血性中風，大腦出血性中風(ICH)和蛛網膜下腔出血性中風(SAH)在內的一類神經系統(tǒng)性疾病，其發(fā)病率和死亡率居高不下。制作方法簡單，可重復性好的動物模型是研究中風損傷發(fā)病機制和治療方法不可或缺的載體，損傷位置、體積、神經功能缺損和腦血流量變化，都可以用來評估模型對于各種治療方法的潛力。本文將對小鼠的缺血性中風、出血性中風模型的制作方法和經驗進行總結同時介紹幾種小鼠中風模型的評價方法。

【關鍵詞】小鼠； 腦出血； 腦缺血

[作者簡介]閆峰(1984-)，男，技師，碩士研究生，研究方向：腦血管病，E-mail： yanfeng@ccmu.edu.cn。

[通訊作者]羅玉敏(1965-)，女，研究員，研究方向：腦血管病，E-mail： yumin111@ccmu.edu.cn。

【中圖分類號】R33【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.013

Research progress of mouse models of focal cerebral stroke

YAN Feng1, ZUO Wei2, LUO Yu-min1

(1. Xuan-Wu Hospital of Capital Medical University, Beijing, 100053, China;

2. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050)

Abstract【】Stroke is a class of neurological disorders including cerebral ischemic stroke, cerebral hemorrhagic stroke (ICH) and subarachnoid hemorrhagic stroke (SAH), which has a high incidence of morbidity and mortality. Simple and reproducible animal model is indispensable for the study of pathogenesis and treatment after stroke insult. Location and size of injury, neurological deficits and cerebral blood flow changes can be used to assess the availability of the model for various treatment methods. Construction methods, designing experience as well as the methods of model assessment were summarized in this article.

【Key words】Mouse; Model; Hemorrhagic stroke; Ischemic stroke; Cerebral stroke

中風具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復發(fā)率的特點，是目前人類死亡的三大主要疾病之一，給社會和家庭帶來沉重的負擔[1]。近年來隨著基因工程的發(fā)展，各種人造的基因缺失或者過表達的小鼠品系的出現(xiàn)為中風的研究帶來了廣闊的前景。腦中風模型的應用也逐漸由大鼠模型向小鼠中風模型發(fā)展，利用小鼠中風模型進行神經保護的開創(chuàng)性實驗取得了巨大的成功[2-3]。本文將對小鼠的缺血性中風、出血性中風模型的制作及評價方法進行綜述。

1小鼠缺血性中風模型的制作

1.1顳肌下開顱大腦中動脈閉塞(dMCAO)模型

Tamura等[4]首次提出并建立一種開顱電凝的MCAO模型，經典方法為：小鼠麻醉后側臥，去除其一側眼與耳之間的被毛，剪開皮膚約0.8 cm，暴露顳肌，將顳肌從顱骨上分離，暴露顱骨后用電鉆鉆開顱骨，暴露大腦皮層供血動脈，分離近端動脈，用電凝或10-0手術絲線結扎大腦中動脈 (MCA)，造成腦梗死。在模型的制作過程中如果條件允許應對股動脈進行分離并插管，定時采集動脈血液對血氣(pO2, pCO2, pH等.)進行監(jiān)測，使動物在正常的生理狀況下進行手術。同時使用激光多普勒腦血流儀監(jiān)測腦血流的變化情況，判斷腦血流是否下降到預期值。此方法制作的缺血中風模型一般不可再灌，不適用于對再灌注損傷的研究。

Tamura-型永久性近端MCAO模型梗死體積取決于動物的種系，缺血時間以及動物處死的時間，如果在嗅束水平以上迅速進行MCAO，紋狀體動脈通常不會受累，如果在次級腦動脈水平進行MCAO，則梗死體積相對較小，但是如果同側頸內動脈永久閉塞且對側頸動脈夾閉1 h，則會增大梗死體積。

Tamura型MCAO的眾多優(yōu)點之一是可以通過部分顱骨切除來檢測到MCA區(qū)域血管的異常，還可以在缺血區(qū)給大腦減壓。因此這個模型腦水腫的體積比線栓模型要低。大腦水腫可以使用腦內部的壓力(ICP)升高，并導致腦內毛細血管灌注下降，從而進一步提高缺血損傷的體積。小鼠的Tamura模型的整體的特點為術后死亡率低 (0% 到 1%) 和重復性高[5]。術后小鼠可能表現(xiàn)出攝食困難，這可能是由于部分顱骨切除時造成的顳肌以及下顎骨損傷造成的，表現(xiàn)為術后體重下降，如果進行長期研究需要關注動物的營養(yǎng)情況，以免造成不必要的死亡。

1.2線栓法大腦中動脈閉塞(MCAO)模型

Koizum等[6]在1986年首次提出并建立線栓法MCAO模型首先建立, 隨后 Zea Longa等[7]一些列學者對其進行了進一步推廣及改進，使其逐漸廣為接受和使用。雖然Zea Longa等使用的是大鼠，但其手術方法也同樣適用于小鼠模型的制作，只是對于手術者的要求要高很多。其經典術式為：將動物常規(guī)麻醉后仰臥固定，頸部正中切口，分離頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和 頸內動脈(ICA)，結扎 ECA后，臨時阻斷CCA和ICA，將ECA結扎處近心端剪斷，使ECA游離，使之與ICA成一直線。對尼龍線進行包被，包被材料可以使用硅膠或者多聚賴氨酸。將包被好的線栓從ECA切口處經過ICA進入顱內區(qū)域，行進約8-9mm略感阻力，提示線栓頭部到達大腦前動脈(ACA)區(qū)域，從而阻斷MCA供血區(qū)的血流。如果在缺血后將線栓留動脈血管內不再拔出，則是永久性缺血模型；如果在缺血一段時間后將動脈內的線栓完全拔出則為缺血再灌注模型。動物的年齡、體重、品系以及線栓的粗細、材質都嚴重影響著模型的成功率。作為實驗室模型可重復性的一部分，配合小鼠動脈血管直徑選擇包被不同圖層厚度的線栓更是十分重要的。雖然現(xiàn)在小鼠線栓已經商品化，但仍有不少實驗室使用自制的線栓也取得了很好的穩(wěn)定性。如果條件允許所有的短暫性腦缺血實驗都要通過激光多普勒血流儀來監(jiān)測皮層局部腦血流量(rCBF)的變化，以確認在插入線栓時腦血流下降到預期數(shù)值，拔出線栓后血流恢復，能夠在MCA區(qū)域重新建立腦血流。

小鼠的手術過程較大鼠操作困難，線栓的位置在不足1 mm的空間內即可影響模型的最終結果，故要特別注意插入線栓的深度和手感。首先線栓的頭部要避免進入翼顎動脈(PPA)殘端，可以在盡可能靠近ICA的地方用10-0單絲尼龍線結扎翼顎動脈。線栓的圖層材料過厚會阻礙線栓進入ICA的顱內部分或者移動過后海馬動脈。這種情況下，如果線栓停留超過24 h，可能會導致后海馬上部的損傷，故應選擇合適的線栓進行模型制作。

術后對模型的評價也極為重要，梗塞大腦一側半球會影響對側肢體的活動。因此，如果在皮層右側以及尾狀核誘導損傷，則小鼠左側前肢和后肢會變弱。輕輕的掐尾巴，動物會試圖逃離，小鼠會逆時針方向轉圈。如果動物從麻醉狀態(tài)清醒過來，順時針轉圈而手術是針對右側大腦，則有可能是形成了血腫。這些觀察結果加上局部腦血流量讀數(shù)的變化可以驗證模型是否成功。線栓模型的優(yōu)勢在于其利用了血管內介入技術進行MCA阻斷，而不需要進行部分顱骨切除。目前普遍認為，線栓阻斷MCA區(qū)供血的方法不開顱、創(chuàng)傷面小，對動物體溫、血壓、血氣以及缺血損傷引起的水腫和顱內壓增高無明顯影響，因此優(yōu)于開顱法。此外由于線栓MCAO法再灌注十分方便，因此在研究腦缺血再灌注損傷中被廣泛應用[8-10]。這個模型的缺點是腦水腫的發(fā)生率、技術并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率稍高。

1.3栓塞法和血栓法MCAO模型

栓塞法和血栓法制作小鼠MCAO模型原理與線栓法基本相同，均是使用物理手段將MCA阻斷以達到使之供血部位缺血的目的，這其中模型成功與否的關鍵因素是栓子的制備。栓子的制備材料有很多，如空氣，碳素顆粒、石蠟以及自體血栓等等，其中自體血栓制備的血塊最普遍[11-15]。但栓塞法最大的缺點是栓子制備及注入過程中的隨機性，無法預測栓塞的部位和大小。

栓塞法模型制作時除用于堵塞血管的物質外，手術方法可參見線栓法模型，在ECA上剪以斜行的小口后，插入內裝制備好的自體血栓的導管，將導管經ICA插至顱腦底部，隨后將血栓順著導管的走向注入，即可實現(xiàn)MCA供血區(qū)的缺血損傷。Traystman等[16]采用自體血制備的血栓栓子纖維蛋白可用來制作大鼠MCAO模型。血栓制作過程為：將動物麻醉后從股動脈抽取動脈血液至內徑為0.2 mm的導管內，導管兩端連接充滿生理鹽水的注射器輪流向導管加壓，使血液在導管內移動凝固，但并不粘附在導管上，后將導管置于37攝氏度的水浴鍋中2 h，后移入4攝氏度冰箱中22 h，使用前將血栓表面紅細胞洗去置于生理鹽水中備用即可。為了更精準的保證高血栓塊安置的位置，Dinapoli等[17]在多普勒成像技術的指導下借助顯微導管輸送栓子進入MCA特定部位，成功的建立更為均一的梗死灶。此類模型的優(yōu)點是：(1)較接近于人類大腦栓塞；( 2)可測試溶栓藥物的作用。缺點：(1)缺血范圍和部位難以預見，再灌過程難以建立；(2)術中污染誘發(fā)感染等炎性反應；(3)嚴重影響側支循環(huán), 神經功能評分等分析較差；(3)適用范圍窄，僅適用于一些特殊的研究如溶栓治療等。

1.4誘導蛛網膜下腔出血的線栓模型

制作蛛網膜下腔出血線栓模型(SAH)，使用6-0或者7-0尼龍栓線閉塞Willis環(huán)并插入大腦前動脈，此過程與MCAO模型的制作方法相同。當線栓前進受到阻力時，再繼續(xù)插入1 mm以確保動脈穿孔，栓線頭部刺穿動脈后立即拔出進行再灌。如果在制作出血模型的過程中持續(xù)監(jiān)測腦血流可以發(fā)現(xiàn)刺破血管后腦血流出現(xiàn)階梯狀下降的特征圖形。

1.5通過注射膠原酶誘導出血性中風模型

血管壁的主要構成成分有蛋白聚糖和多種類型的膠原。膠原酶可被分為I～VIII型，是一類特殊的金屬基質蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)能夠降解細胞外間質以及基底膜中的膠原。IV型和VII型膠原酶廣泛用于制備動物的腦出血模型。膠原酶注入20min后即可通過降解腦血管基底膜上的膠原蛋白造成血管壁的損傷，導致滲血現(xiàn)象的發(fā)生， 4小時左右即發(fā)展為片狀出血。膠原酶使用的劑量決定了出血區(qū)面積的大小。

其手術具體方法為常規(guī)麻醉后將小鼠俯臥，頭頂備皮后在正中做1 cm切口，暴露小鼠顱骨，將小鼠固定于立體定位儀上，確定其前囟中點，以前囟為0點，向前0.7 mm，向右2 mm處為尾狀核于顱骨投影處，用32G針頭的1 μL微量注射器刺破入顱骨4～5 mm，將計算好劑量的膠原酶(0.15 U/μL)生理鹽水溶液0.5 μL緩慢注入即可，注射時間應大于20 min[18]。膠原酶自身就具有一定的毒性，導致大腦出血區(qū)細胞出現(xiàn)壞死，此外出血區(qū)周圍的水腫部位可觀察到炎性細胞的浸潤。該模型屬于滲出性模型，血腫程度較均一，神經功能缺陷較明顯，成為腦出血研究中廣泛應用動物模型之一。

2中風的行為學評估

在臨床上，習慣將中風患者的神經功能損傷大致分為一般功能損傷和局灶性功能損傷。前者反應的是患者生命狀態(tài)和整體神經功能，后者反應損傷造成的定位性功能缺陷，本文將介紹3種國內外常用的中風后小鼠的行為學評估的標準。分別為Bederson小鼠行為學評分[19]，Clakr 評分小鼠一般功能損傷評分和Clark評分小鼠局灶功能損傷評分[20]。需要注意的是：嚴重行為缺陷的小鼠容易出現(xiàn)嚴重的低溫，因此需要持續(xù)維持恒溫的環(huán)境。低溫對短暫性缺血的影響要明顯大于對永久性缺血的影響，另外和大鼠不一樣，前臂肢體屈曲不是一個可靠的小鼠行為學跡象，因此不包括在數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計中。

以上介紹的3中評價方法各有優(yōu)缺點，Bederson評分方法因其簡單實用，評價準確而在國內被廣泛應用；Clark評分對多項神經功能進行了較為全面的評價，操作性好，對動物模型的評價更具體。

3總結

在許多種類的動物中都可以成功的重復中風模型：松鼠猴，沙鼠，兔，貓和狗。作為一個經驗法則，動物物種越大，缺血損傷的大小和定位的差異性越大。如豐富的大腦側支循環(huán)使得狗很難用于中風的研究，需要夾閉很多動脈分支才能很好的復制腦缺血損傷的模型。小動物比如小鼠和大鼠，則更容易操作，經濟性更好而且隨時可以得到。另外, 采用廉價、血管解剖近似于人的小鼠為實驗對象還有其他優(yōu)勢, 例如腦組織小生化、組化檢測費用低, 節(jié)約實驗耗材等。小鼠的腦中風模型為系統(tǒng)研究中風的病理生理損傷及各種治療干預提供了一個重現(xiàn)性好、可控的研究載體。

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〔修回日期〕2014-10-27