余婉婷 湛 洋 雷昕諾 張 顏 謝小紅 王乃東 鄧治邦 王愛兵 楊 毅

(湖南農業(yè)大學,湖南長沙 410128)

豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的研究及應用

余婉婷 湛 洋 雷昕諾 張 顏 謝小紅 王乃東 鄧治邦 王愛兵 楊 毅*

(湖南農業(yè)大學,湖南長沙 410128)

自20世紀90年代中期起，豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）引起的豬圓環(huán)病毒病在全球范圍內大規(guī)模爆發(fā)，給世界各國造成了巨大的經濟損失和環(huán)境災難。2013年，英國皇家獸醫(yī)學院Alarcon，P等對PCV2給英國養(yǎng)豬業(yè)所造成的經濟損失進行了科學的統(tǒng)計，研究結果表明，2008年PCV2造成5.23千萬英鎊的損失，而在PCV2流行期所造成的直接經濟損失可達8.8千萬英鎊[1]。我國生豬出欄量居世界第一，占據(jù)世界約50%的產量。但是，豬圓環(huán)病毒對我國養(yǎng)豬業(yè)的影響也相當巨大，造成每年至少數(shù)百億人民幣的直接經濟損失。2013年初，上海黃浦江上出現(xiàn)大量的死豬，官方報道，豬圓環(huán)病毒是唯一檢測出的病原體。豬圓環(huán)病毒不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的經濟損失，而且影響我國的食品安全、環(huán)境保護和大眾身心健康等。相關研究結果表明，PCV2的核衣殼蛋白質（Capsid）能在大腸桿菌中高效表達，純化的蛋白質能在體外組裝成具有細胞浸染性病毒樣顆粒（VLPs）。通過蛋白質純化技術，獲得與野生型病毒大小、免疫原性類似的VLPs。由于VLP在免疫原性與野生型病毒非常相似，且不攜帶病毒的基因組，具有非常高的生物安全性，因此，VLP作為新一代人類和動物疫苗具有非常好的開發(fā)前景。

1 豬圓環(huán)病毒的基因分型

豬圓環(huán)病毒是單鏈、環(huán)狀DNA病毒，分類學上屬圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬。豬圓環(huán)病毒主要包括兩個基因型：豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）[2，3]。PCV1最早在20世紀70年代被發(fā)現(xiàn)作為非致病性的細胞污染物在豬腎上皮細胞（PK15）中存在[4]。PCV2則被認為是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PWMS）及圓環(huán)病毒相關疾病（PCVAD）的主要病原體[2]，其基因組含有大約1 766～1 768 個堿基，編碼兩個主要的蛋白質（Cap和Rep/Rep’）。病毒顆粒平均大小在12～23 nm左右[2]，是目前世界發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒之一。PCV2分為3個主要基因亞型：PCV2a，PCV2b和PCV2c。PCV2a和 PCV2b是目前世界主要流行的毒株，而PCV2c僅在丹麥報道過。根據(jù)病毒基因組的差異，而PCV2a又可分為：PCV2A、PCV2B、PCV2C、PCV2D、PCV2E，PCV2b又可分為：PCV、PCV、PCV[3]。

1A1B1C

2 PCV2免疫抑制作用的研究進展

分子免疫學研究表明PCV2通過感染豬的免疫細胞[5]（主要是樹突狀免疫細胞，DC），對漿細胞樣樹突狀細胞（pDCs），又稱天然干擾素產生細胞（NIPCs）產生免疫調控作用，導致NIPCs細胞受到其他病原體入侵或者CpG寡核苷酸（CpG-ODN）等因子的刺激或誘導后，產生的干擾素-α和腫瘤壞死因子-α的功能喪失，產生免疫沉默，機體的天然免疫功能喪失[6]。進一步的研究表明，PCV2DNA是導致 NIPCs免疫沉默的直接原因[7]，并損害pDCs和單核細胞來源的樹突細胞（DC）肌動蛋白的聚合功能及這些細胞的內吞作用[8]。豬圓環(huán)病毒病在臨床上常表現(xiàn)為PCV2與其他病原體的混合型感染[9，10]（如，豬藍耳病病毒、豬細小病毒和豬肺炎支原體等）。因此，一種可能性的病理機制為：由其他病原體所引起的感染，導致非特異性地免疫激發(fā)，并且有可能通過改變細胞免疫（如，細胞因子的產生和種類）造成PCV2在豬免疫細胞中大量的復制和積累；同時，PCV2的大量擴增進一步產生免疫抑制，導致豬對其他病原體產生更強的易感性[9，11]。由于PCV2和其他病原體之間的相互促進作用會對豬產生很強的致病力，因而PMWS綜合征導致豬死亡率非常高，可達到90%以上[12]。大量的基礎研究和臨床實驗數(shù)據(jù)使很多研究者產生共識：PCV2所導致的PWMS是一種獲得性免疫缺陷癥[10，13，14]。

目前，正在評估豬圓環(huán)病毒對人體細胞的浸染性及其危害。由于人體疫苗生產過程中大量使用到動物血清和胰蛋白酶，最近，在人輪狀病毒（rotavirus）和脊髓灰質炎病毒（poliovirus）的疫苗及生產這些疫苗所使用的細胞中檢測出到PCV1和PCV2DNA[15，16]，體外細胞培養(yǎng)實驗證明，PCV在細胞中具有浸染和擴增的特性，并不斷產生適應期宿主細胞的基因突變[15]。Beach，NM 等研究證明PCV1能浸染人肝臟腫瘤細胞，并且能有效擴增[17]；體外細胞實驗證明PCV1能浸染人T淋巴細胞，引起細胞發(fā)生病變[18]。

3 PCV2入侵細胞機制的研究近況

PCV2入侵宿主細胞主要有兩個關鍵步驟：（1）吸附；（2）入侵。首先，PCV2與宿主細胞膜表面受體相互作用。到目前為止，并沒有PCV2的特異性受體的報道。很多病毒利用黏多醣（GAG）作為細胞膜上的廣譜性受體，Misinzo G.等報道PCV2VLPs可通過與細胞表面硫酸乙酰肝素（HS）或者硫酸軟骨素B（CS-B）結合而浸染細胞[19]。減少以上受體分子在細胞膜上的分布，將會明顯抑制PCV2VLPs的浸染。PCV2的細胞內化過程的分子機理目前還不是十分清楚，有研究認為，PCV2在不同的細胞系中，使用不同的浸染途徑。例如，在豬的3D4/31 單核細胞系中，PCV2是通過Clathrin介導的內吞作用進入細胞，產生浸染[20]。然而，在豬腎上皮細胞（PK15 cells）中，PCV2也可以通過Clathrin介導的內吞作用進入細胞，但此途徑并不能導致病毒在細胞中有效復制，相反抑制Clathrin介導的內吞作用，可以大幅度提高PCV2浸染PK15細胞的能力[21]。很明顯，在PK15細胞系中存在著一種我們未知的PCV2浸染機制，但以上各種浸染過程都依賴于絲狀肌動蛋白，在培養(yǎng)基中加入actin聚合抑制劑，會導致PCV2失去浸染能力[20，21]。PCV2浸染樹突狀細胞后，并不會立即啟動復制，但其對細胞依舊能保持感染力，由此可以推測PCV2可能是利用一種未知的免疫入侵機制，逃逸免疫細胞降解的途徑來感染其他細胞，與此同時，PCV2病毒借助于樹突狀細胞自身的遷移能力，將其作為自身傳播的載體，在不進行自我復制的情況下完成持續(xù)感染[22]。

盡管近些年已經對PCV2浸染機理做了初步的研究，但是，PCV2的內吞途徑、與細胞骨架及宿主細胞的相互作用以及產生免疫的分子機理仍然不清楚，而這些對我們從根本上理解PCV2的致病機理及疫苗的研究與應用等都起著十分重要的作用。普通的細胞培養(yǎng)很難產生高滴度的PCV2，因此，研究都使用到較高濃度的PCV2VLPs代替PCV2來研究其浸染機理[19～21]。

4 PCV2 VLPs 國內外研究與開發(fā)的現(xiàn)狀

借助于昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)已經成功地表達PCV2的核衣殼蛋白質[23，24]，通過密度梯度離心后可以獲得高純度的PCV2VLPs。在此基礎上開發(fā)的PCV2VLPs亞單位疫苗，已經成為目前國際市場的主要疫苗種類。其免疫保護效果非常好，自使用后，PCV2的流行在歐美等地得到迅速控制，產生很好的社會及經濟效益。但是，利用昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)生產PCV2VLPs疫苗生產工藝復雜、價格高，限制了其大規(guī)模使用。目前我國還不具備生產能力，并且由于價格原因（在我國，調查顯示PCV2疫苗的價格是決定養(yǎng)豬業(yè)主是否使用疫苗的首選因素[25]），進口疫苗的使用率非常低。如果利用其他表達系統(tǒng)（如：原核表達系統(tǒng)等產生PCV2VLPs）將大幅度降低PCV2VLPs的生產成本。很多研究者利用大腸桿菌表達PCV2的Capsid蛋白質，并在體外組裝成，但多數(shù)是以失敗告終[26]，2013年，Yin等將Sumo-標簽融合到PCV2Capsid基因5 ’端，能提高Capsid蛋白質在大腸桿菌中表達及可溶性，純化后的融合蛋白質，通過酶切去掉Sumo-標簽后，PCV2Capsid蛋白質能在體外成功地組裝成PCV2VLPs[27]。

5 VLPs研究和開發(fā)的意義

VLPs 的研究和開發(fā)具有十分重要的生物學意義，是目前生物醫(yī)學研究的熱點和重點。VLPs具有以下基礎及應用價值：（1）VLPs保留有野生型病毒顆粒的免疫原性，但不含有病毒基因組成分。因此，具有很好的免疫原性和生物安全性；（2）VLPs能有效地刺激機體產生天然免疫（類似于佐劑）。由于VLPs的顆粒大小一般在20～100 nm，較普通蛋白質抗原要大得多，所以它們也能更好地刺激機體產生非特異性免疫；（3）基于VLPs的二價和多價疫苗。由于VLPs是多亞基蛋白質復合物，可以通過基因工程的方法，將其他病原體的中和抗體表位插入到某個病毒VLPs的非關鍵區(qū)，從而產生多價疫苗；（4）可以作為新一代人類和動物藥物載體：藥物分子如何跨過細胞膜的屏障作用有效地進入細胞，一直以來是生物醫(yī)學研究的難點和重點問題。VLPs具有與野生型病毒類似的細胞浸染能力，所以，它們能夠有效地攜帶藥物分子、siRNA甚至DNA分子進入細胞。如，人類子宮頸乳頭瘤狀病毒的VLPs能有效攜帶干擾性RNA分子進入到靶細胞，從而起到有效地治療作用[28]。

6 VLPs的研究和應用存在的挑戰(zhàn)

VLPs作為疫苗，與傳統(tǒng)疫苗比較，相關的設計、表達、組裝及純化等對技術條件要求比較高，而且不是所有病毒都能組裝成VLPs。同時，以VLPs為基礎的二價或多價疫苗，需要對VLP載體本身的蛋白質結構和功能進行大量的基礎研究。例如，以蛋白質三維結構為基礎的，將另外一個或多個病原體的中和抗體表位插入到VLP中s，需要保證其插入點不影響VLPs的表達和組裝，且不影響兩者的免疫原性和細胞浸染性等。

目前，許多病毒VLPs的表達都是以哺乳動物細胞或者昆蟲細胞為表達系統(tǒng)，造成生產成本過高，限制了其大規(guī)模應用。還需要解析VLPs的體外組裝、去組裝的分子機理等來實現(xiàn)VLPs作為藥物載體可能性。

7 PCV2VLPs的研究和應用的優(yōu)勢

很多病毒VLPs 的表達和組裝需要共表達兩個或者兩個以上不同的病毒衣殼蛋白質（VP1，VP2等），這樣為VLPs 設計和制備提高了難度。而PCV2VLPs僅由一種核衣殼蛋白質構成，僅需要表達一種蛋白質就能有效地產生VLPs。PCV2Capsid 蛋白質的三維晶體結構已于2011年被解析出來[29]，為以PCV2VLPs作為載體的二價及多價動物疫苗提供了基礎。

研究發(fā)現(xiàn)，PCV2以硫酸乙酰肝素（HS）作為廣譜性受體，但目前沒有發(fā)現(xiàn)PCV2的特異性細胞受體[30]。從其細胞入侵動力學過程來看，很多學者認為PCV2的浸染并不需要特異性受體，因此，它對大多數(shù)哺乳動物細胞都具有浸染性。因而，對PCV2VLPs改造后，可以作為動物及人體藥物攜帶的有效載體。

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余婉婷，女，1990年出生，湖南常德人，湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學預防獸醫(yī)碩士生，郵箱：ywt1017806202@163.com

“國家自然科學基金項目”(31372406), “國家自然科學基金項目”(1014 2R0176)

， E-mail：yangyi.proc@gmail.com