李錦程，趙海蘋，羅玉敏

（首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院，腦血管病研究室，北京 100053）

不同劑量酒精干預腦缺血動物模型的研究進展

李錦程，趙海蘋，羅玉敏

（首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院，腦血管病研究室，北京 100053）

酒精與腦缺血發(fā)生和預后都密切相關，用不同動物模型研究酒精與腦缺血的關系得出的結果不盡相同。本文總結了目前常用的酒精干預腦缺血動物模型的制作方法，并對模型的優(yōu)缺點進行評價，為酒精干預腦缺血研究中動物模型的選擇提供參考。

酒精；腦缺血；腦卒中；模型，動物

有研究表明：飲酒與腦缺血相關［1，2］。Patra等分析發(fā)現(xiàn)：與不飲酒的男性相比，每天飲酒35 g以下能降低男性缺血性卒中的死亡風險，每天飲酒12 g時死亡風險最低；對于女性，每天飲酒44 g以下能降低缺血性腦卒中的死亡風險，死亡風險最低的女性每天飲酒少于12 g；男性每天飲酒少于37 g或女性每天飲酒少于46 g，缺血性腦卒中的發(fā)病風險下降；每天飲酒12杯（每杯約含酒精12 g），缺血性腦卒中的發(fā)病風險最高（以上酒的克數(shù)指純酒精含量）［1］。動物模型研究也表明酒精與腦缺血關系密切［3，5，19］。由于實際操作中倫理等方面的各種限制，研究酒精對腦缺血的作用不能在人體進行，動物模型便成為研究替代工具。目前酒精干預腦缺血主要使用大鼠、小鼠、沙鼠制作動物模型，研究者根據(jù)實驗目的采用不同的酒精給予方式、劑量、給予時間、持續(xù)時間，采用不同的腦缺血方法。本文綜述了以往研究使用過的酒精干預腦缺血模型，并對模型的優(yōu)缺點進行評價。

1 大鼠模型

使用大鼠造模的實驗中，主要應用的是Wistar和Sprague-Dawley雄性大鼠，Wistar大鼠體重大多在（180～320）g，Sprague-Dawley大鼠體重范圍大多在（230～300）g。

1.1 Wistar大鼠

應用Wistar大鼠的研究，酒精干預均在腦缺血之前。Favalli等［3］把10％v/v的酒精作為唯一的飲品，持續(xù)給予大鼠28 d。為研究不同時期酒精的作用，分別在給予酒精28d時或停止給酒精后24 h用光化學誘導血栓形成的方法造成大腦額頂葉皮質(zhì)缺血，觀察缺血的額頂葉皮質(zhì)區(qū)谷氨酸的釋放。采用Montalbetti［4］等使用過的光化學聯(lián)合微透析的方法，發(fā)現(xiàn)飲酒28 d能輕微減少缺血后谷氨酸的釋放，但并不減輕腦損傷；而停止飲酒24 h的大鼠缺血后腦損傷更重，同時谷氨酸和天門冬氨酸釋放增加。用類似方法，研究［5］發(fā)現(xiàn)缺血前1.5 h腹腔注射1.5、3.0 g/kg酒精能顯著減少局灶性腦缺血后谷氨酸的釋放，但不能顯著減輕腦損傷。

這種模型適于研究酒精對血小板、血栓形成的影響，而且此模型不需要開顱，動物存活時間長，適于慢性酒精聯(lián)合腦缺血研究；此外，皮層梗塞部位可任意選擇，為研究酒精對特定部位皮層缺血的影響提供了條件。但它與人類常見的腦栓塞存在差異，是動脈永久性閉塞，不能觀察酒精對腦血管再通后的影響。

吳光、金鮮花等［6，7］研究長期飲酒大鼠腦缺血后血漿降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）、神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）、內(nèi)皮素（endothelin，ET）水平的變化。把95％的醫(yī)用酒精配制成7.2％的酒精，供大鼠代水自由飲用100 d。線栓法制作局灶性腦缺血模型，缺血前、缺血后1、3、6 h左心室取血測定血漿CGRP、NPY、ET，發(fā)現(xiàn)長期飲酒可使腦梗死超早期血漿CGRP降低、NPY和ET升高。他們研究長期飲酒大鼠缺血腦組織中Fas-L抗原表達［8］時，使用（250～320）g大鼠，造模方法與以上大致相同，不同之處為酒精代水自由飲用時間為12周，結果發(fā)現(xiàn)長期飲酒使缺血后Fas-L陽性表達高峰提前。

以上實驗均用酒精代水使動物自由攝入，有可能造成攝入酒精量之間的差別，從而影響實驗結果。

1.2 Sprague-Dawley大鼠

1.2.1 腦缺血前酒精干預：用未禁食或禁食一夜的大鼠研究酒精對局部腦缺血的急性作用，包括對大腦水腫和腦內(nèi)鈉、鉀離子含量的影響。用5％的葡萄糖配制成20％或30％的酒精，左側大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）前1 h腹腔注射酒精2 g/kg或3 g/kg，缺血持續(xù)4 h后取腦測定水和離子含量。研究表明2 g/kg酒精增加未禁食大鼠腦水腫和腦內(nèi)鈉離子含量，酒精的這種神經(jīng)毒性作用可能與升高血糖有關［9］。在禁食一夜的大鼠，腹腔注射酒精聯(lián)合腦缺血后沒有出現(xiàn)血糖升高，3 g/kg劑量的酒精加重大鼠腦水腫，2 g/kg劑量的酒精不加重腦水腫，且3 g/kg酒精的神經(jīng)毒性作用與血糖濃度無關［10］。

也有學者使用大鼠全腦缺血模型研究酒精對腦缺血-再灌注損傷后的影響［11，12］。單邊側腦室注射0、2.0、8.0、12.0、16.0、18.0或20.0 mg/kg的酒精（100％，溶于水，40％v/v）。缺血前20 min第一次注入酒精，間隔24 h，共注射3次。使用立體定位注射器以0.5 μL/min的速度注入酒精，注入10 min后，以1 mm/min的速度拔出注射器，縫合切口。缺血15 min再灌注3或5d。發(fā)現(xiàn)8.0-12.0 mg/kg酒精能激活紅藻氨酸（kainate，KA）受體中的Gluk1，促進依賴 Ca2+的 γ-氨基丁酸（gammaaminobutyric acid，GABA）釋放，激活突觸后GABAA受體，抑制 c-Jun氨基端激酶3（c-Jun N-terminal kinase 3，JNK3）凋亡通路，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

Zhao等［13］發(fā)現(xiàn)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NAD（P）H）氧化酶在長期飲酒加重缺血腦損傷中有重要作用。他們使用（200～220）g大鼠，流質(zhì)酒精飲食（Dyets，Bethlehem，PA）8周。流食中乙醇含量為6.4％v/v，食物熱量為1.0 kcal/mL，其中35％來自脂肪，11％來自碳水化合物，18％來自蛋白質(zhì)，36％來自乙醇；有數(shù)據(jù)表明，這種飲食時大鼠血液中酒精濃度大約為20 mmol/L［14］。8周后阻塞大腦中動脈2 h、再灌注24 h引起腦損傷。也有學者用同樣的模型研究過長期飲酒對短暫性腦缺血后腦損傷的影響［15］，發(fā)現(xiàn)酒精減弱缺血過程中局部腦血流的反彈性增加。研究長期飲酒對大腦缺血/再灌注損傷影響的劑量依賴性時，Zhao等同樣使用此模型，1.0 kcal/mL的流質(zhì)飲食中含1、3、5或6.4％（v/v）酒精，給予非酒精飲食組、1、3或5％（v/v）酒精飲食組的每日飲食量以6.4％（v/v）酒精飲食為基準［16］，1％酒精減小梗塞體積，6.4％酒精增大梗塞體積，3％或5％酒精對梗塞體積無明顯影響。以上模型酒精的干預均在腦缺血之前，模擬了長期飲酒的腦血管病的發(fā)生狀況，可以選擇此類模型研究臨床中不能完成的機制研究。

1.2.2 腦缺血之后酒精干預：Wang等［17］用管腔內(nèi)線栓阻斷模型研究腦缺血后急性酒精干預的神經(jīng)保護作用，使用（280～300）g大鼠。為研究不同劑量酒精的作用，把0.5、1.0或1.5 g/kg劑量的酒精用生理鹽水稀釋成3 mL，于灌注開始時腹腔注射，再灌注48 h后測定腦梗死體積，發(fā)現(xiàn)：與給予生理鹽水相比，1.5 g/kg酒精能把梗塞體積減小47％，1.0 g/kg能減小23％，0.5 g/kg沒有減小梗塞體積；為探究治療時間窗，于MCAO后2、3、4 h腹腔注射1.5 g/kg劑量的酒精，再灌注48 h后測定腦梗塞體積，發(fā)現(xiàn)MCAO后4 h給予酒精仍能減小梗塞，改善神經(jīng)功能；為研究酒精與低體溫是否有協(xié)同疊加的神經(jīng)保護作用，MCAO后90 min向大鼠全身噴灑酒精將大鼠核心體度降至（32～33）℃，MCAO 2 h后停止噴酒精且大鼠自動恢復體溫與此同時腹腔注射1.5 g/kg酒精，發(fā)現(xiàn)酒精與低體溫沒有疊加的神經(jīng)保護作用；酒精沒有促進缺血性中風時的腦出血，另外，在缺血性中風時，酒精不增加重組組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissue-type plasminogen activator，rtPA）或尿激酶（urokinase，UK）應用后的腦出血；缺血后2 h給予1.5 g/kg酒精，再灌注 3 h測定低氧誘導因子-1α（hypoxiainducible factor-1，HIF-1α），發(fā)現(xiàn) HIF-1α增加。有研究還表明［18］，常壓氧（normobaric oxygenation，NBO）聯(lián)合酒精對腦缺血有協(xié)同神經(jīng)保護作用，MCAO 2 h后，于再灌注開始時腹腔注射1.0 g/kg酒精（用生理鹽水稀釋成3ml），然后給予2 h常壓氧（95％O2），這種保護效應可能與ADP/ATP比例、活性氧、NADPH氧化酶活性降低，丙酮酸脫氫酶活性增強有關。Zeng等［19］在MCAO 2 h后，于灌注開始時腹腔注射1.5 g/kg酒精，再灌注24 h測腦水腫、再灌注48 h觀察血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的完整性，發(fā)現(xiàn)酒精能減輕腦缺血-再灌注后的腦水腫和BBB破壞，可能與酒精減少基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和水通道蛋白（aquaporin，AQP）有關。

總之，在制備酒精干預腦缺血模型中，腦缺血2 h MCAO/24 h、48 h再灌注模型使用較多。Sprague-Dawley大鼠是制備酒精干預腦缺血模型中最常用的動物。長期飲酒后腦缺血最符合人類發(fā)病順序的模型。

2 小鼠（C57BL/6和C57BL/6J）模型

在小鼠模型的研究中，研究者多使用2月齡小鼠，且酒精均在腦缺血之前給予。Wang等［20］研究酒精預處理（ethanol preconditioning，EtOH-PC）減輕腦缺血-再灌注后白細胞-內(nèi)皮細胞粘附和遲發(fā)性神經(jīng)元死亡與 Ca+激活的 K+（calcium-activated potassium，BKCa）通道激活有關。用［體重（g）× 0.6+0.3］計算95％酒精給予量（μL），用無菌蒸餾水把酒精稀釋成0.3 mL，在缺血前24 h灌胃。因為EtOH-PC的早期（1～2 h后）腦保護作用弱于晚期（24 h后），所以選擇在酒精預處理后24 h進行腦缺血-再灌注。夾閉雙側頸總動脈（common carotid arteries，CCA）20 min造成腦缺血。再灌注2 h和3 h后測定軟膜小靜脈中滾動的白細胞和粘附的白細胞的數(shù)量，再灌注4 d后觀察海馬區(qū)DND、凋亡和膠質(zhì)細胞激活。

Sun等［21］研究低劑量飲酒可能通過上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferatoractivated receptor gamma，PPARγ）減輕小鼠短暫性局灶腦缺血損傷。采用的也是流質(zhì)1％（v/v）酒精（Dyets，Bethlehem，PA）飲食8周，飲食所含能量為1.0 kcal/mL，其中35％來自脂肪，18％來自蛋白質(zhì)，42％來自碳水化合物，5％來自乙醇。酒精飲食后0.5、1、2、4 h血液酒精濃度分別為0.8、1.0、0.5、0 mM。線栓法制備MCAO，缺血90 min再灌注24 h后觀察腦梗死、DNA斷裂和核PPARγ蛋白/活性。

目前，使用小鼠（C57BL/6和C57BL/6J）研究酒精和腦缺血的關系，優(yōu)勢在于多數(shù)轉(zhuǎn)基因為小鼠（C57BL/6和C57BL/6J），可以用于特定基因功能方面的研究。但缺血性腦卒中在老年人中較為常見，這些實驗使用的小鼠年齡偏小。

3 沙鼠模型

在沙鼠模型的研究中，酒精干預也在腦缺血之前，沙鼠體重大多在（50～80）g，且研究者基本采用阻塞雙側CCA 5 min制備短暫全腦缺血模型。Xia等將酒精以22.5％（w/v）的濃度混合于奶粉中，用4 g/kg灌胃35d。35 d后，夾閉雙側CCA 5 min，再灌注48 h。發(fā)現(xiàn)酒精沒改變海馬CA1區(qū)缺血后1，4，5-三磷酸肌醇受體（inositol 1，4，5-triphosphate receptor，IP3R1）mRNA、肌質(zhì)網(wǎng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶（sarcoplasmic or endoplasmic Ca2+-ATPase， SERCA2b）mRNA的下降［22］。

McCrea等把1 g/kg或4 g/kg酒精與生理鹽水混合成1 mL，皮下注射，持續(xù)21 d。停止注射酒精9 d，使動物恢復體重。之后阻塞雙側CCA 5 min造成腦缺血，發(fā)現(xiàn)酒精減少谷氨酸釋放，而再灌注1月后發(fā)現(xiàn)酒精沒改變沙鼠腦缺血后的組織學和神經(jīng)行為學結局［23］。該團隊同樣采用皮下注射1 g/kg或4 g/kg酒精，酒精注射后1 h后阻塞雙側CCA 5 min造成腦缺血，通過水迷宮實驗和觀察術后1月紋狀體、海馬、丘腦等的病理改變，發(fā)現(xiàn)急性酒精干預不能改變短暫性腦缺血-再灌注后的結構和功能變化［24］。Phillis等在缺血前30 min給予沙鼠腹腔注射1.02 g/kg（即22 mmol/kg）乙醇（與鹽水以6：5混合），后阻塞雙側CCA造成全腦缺血5 min，再灌注5d后發(fā)現(xiàn)海馬CA1錐體神經(jīng)元損失減少［25］。

酒精干預全腦缺血模型時，沙鼠比大鼠死亡率低［26］，為避免高死亡率使用沙鼠造模更合適。但是，由于沙鼠腦部血管發(fā)育存在個體差異，阻斷雙側CCA半小時以上，僅30％左右的沙鼠會出現(xiàn)腦缺血，因此，如果進行更長時間的腦缺血研究，模型可靠性大大降低［27］。

4 小結

由于種屬差異的存在，酒精干預腦缺血動物模型不能完全模擬人類的發(fā)病狀況。有實驗表明Sprague-Dawley大鼠每千克體重能夠比人耐受更多酒精，所以動物模型的酒精劑量-效應關系不能直接應用于人［10］。除種屬差異外，腦缺血在人群發(fā)病與年齡和性別有很大關系，而大多數(shù)實驗使用雄性、青壯年動物，忽略了性別、年齡的影響。而且，人類飲酒不可能像實驗動物一樣有規(guī)律，缺血性腦卒中發(fā)作后的缺血持續(xù)時間也不相等，相應模型難以準確模擬人類發(fā)病。另外，麻醉也影響動物生命體征。同時，人類腦缺血發(fā)病與遺傳、環(huán)境、生活習慣、疾病狀況等多種因素有關，這些因素都很難在動物身上得到再現(xiàn)。

綜上所述，應用于酒精干預腦缺血研究的嚙齒類動物模型有很多，不同的動物模型各具特點，理想的動物模型是研究疾病發(fā)生機制和藥物開發(fā)的關鍵，所以應綜合考慮種屬差異、個體差異以及研究目的等因素建立合適的酒精干預腦缺血動物模型。

［1］Patra J，Taylor B，Irving H，et al.Alcohol consumption and the risk of morbidity and mortality for different stroke types—a systematic review and meta-analysis［J］.BMC Public Health，2010，10：258.

［2］Reynolds K，Lewis B，Nolen JD，et al.Alcohol consumption and risk of stroke：a meta-analysis［J］.JAMA，2003，289（5）：579 -588.

［3］Favalli L，Rozza A，F(xiàn)rattini P，et al.Ischemia-induced glutamate release in rat frontoparietal cortex after chronic alcohol and withdrawal［J］.Neurosci Lett，2002，326（3）：183-186.

［4］Montalbetti L，Rozza A，Rizzo V，et al.Amino acid recovery via microdialysis and photoinduced focal cerebral ischemia in brain cortex of rats［J］.Neurosci Lett，1995，192（3）：153-156.

［5］Masoero E，F(xiàn)rattini P，F(xiàn)avalli L，et al.Effect of acute alcohol on ischemia-induced glutamate release and brain damage［J］.Alcohol，2000，22：173-177.

［6］金鮮花，劉超，趙和榮，等.長期飲酒大鼠腦缺血模型血漿CGRP的測定［J］.神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生，2003，3（5）：387 -388.

［7］吳光，金鮮花，劉超，等.長期飲酒腦缺血大鼠血漿NPY、CGRP、ET含量的測定［J］.中風與神經(jīng)疾病雜志，2004，21（4）：323-325.

［8］吳光，劉超，金鮮花，等.長期飲酒大鼠缺血腦組織Fas-L抗原表達的動態(tài)研究［J］.中風與神經(jīng)疾病雜志，2003，20（2）：163-165.

［9］Zhao YJ，Yang GY，Domino EF.Acute ethanol effects on focal cerebral ischemia in nonfasted rats［J］.Alcohol Clin Exp Res，1997，21（4）：745-748.

［10］Zhao YJ，Yang GY，Ben-Joseph O，et al.Acute ethanol effects on focal cerebral ischemia in fasted rats［J］.Alcohol Clin Exp Res，1998，22（3）：717-722.

［11］Qi SH，Liu Y，Hao LY，et al.Neuroprotection of ethanol against ischemia/reperfusion-induced brain injury through decreasing c-Jun N-terminal kinase 3（JNK3）activation by enhancing GABA release［J］.Neuroscience，2010，167（4）：1125-1137.

［12］Qi SH，Liu Y，Wang WW，et al.Neuroprotection of ethanol againstcerebralischemia/reperfusion induced brain injury through GABA receptor activation［J］.Brain Res，2009，1276：151-158.

［13］Zhao H，Mayhan W G，Arrick DM，et al.Alcohol-induced exacerbation of ischemic brain injury：role of NAD（P）H oxidase［J］.Alcohol Clin Exp Res，2010，34（11）：1948-1955.

［14］SunH，Molacek E，Zheng H，etal.Alcohol-induced impairment of neuronal nitric oxide synthase（nNOS）-dependent dilation of cerebral arterioles：role of NAD（P）H oxidase［J］.J Mol Cell Cardiol，2006，40（2）：321-328.

［15］Sun H，Zhao H，Sharpe GM，et al.Effect of chronic alcohol consumption on brain damage following transient focal ischemia［J］.Brain Res，2008，1194：73-80.

［16］Zhao H，Mayhan WG，Arrick DM，et al.Dose-related influence of chronic alcohol consumption on cerebral ischemia/reperfusion injury［J］.Alcohol Clin Exp Res，2011，35（7）：1265-1269.

［17］Wang F，Wang Y，Geng X，et al.Neuroprotective effect of acute ethanol administration in a rat with transient cerebral ischemia［J］.Stroke，2012，43（1）：205-210

［18］Geng X，F(xiàn)u P，Ji X，et al.Synergetic neuroprotection of normobaric oxygenation and ethanol in ischemic stroke through improved oxidative mechanism［J］.Stroke，2013，44（5）：1418-1425.

［19］Zeng X，Asmaro K，Ren C，et al.Acute ethanol treatment reduces blood-brain barrierdysfunction followingischemia/reperfusion injury［J］.Brain Res，2012，1437：127-133.

［20］Wang Q，Kalogeris TJ，Wang M，et al.Antecedent ethanol attenuates cerebral ischemia/reperfusion-induced leukocyteendothelial adhesive interactions and delayed neuronal death：role of large conductance，Ca2+-activated K+channels［J］.Microcirculation，2010，17（6）：427-438

［21］Sun H，Xiong W，ArrickDM，et al.Low-dose alcohol consumption protects against transient focal cerebral ischemia in mice：possible role of PPARγ［J］.PLoS ONE，2012，7（7）：e41716.

［22］Xia J，Simonyi A，Sun GY.Changes in IP3R1 and SERCA2b mRNA levels in the gerbilbrain after chronic ethanol administration and transient cerebral ischemia-reperfusion［J］.Brain Res Mol Brain Res，1998，56（1-2）：22-28.

［23］McCrea S，Wishart T，Miyashita H，et al.Attenuated glutamate release during ischemia in ethanol-administered gerbils［J］.Neuroreport，1997，8（15）：3385-3388.

［24］McCrea S，Miyashita H，Wishart T，et al.Acute ethanol administration and transient ischemia：a behavioral and neuropathological study［J］.Life Sci，2000，66（14）：1337 -1343.

［25］Phillis JW，Estevez AY，O’Regan MH.Protective effects of the free radical scavengers，dimethyl sulfoxide and ethanol，in cerebral ischemia in gerbils［J］.Neurosci Lett，1998，244（2）：109-111.

［26］Crews FT，Steck JC，Chandler LJ，et al.Ethanol，stroke，brain damage，and excitotoxicity［J］.Pharmacol Biochem Behav，1998，59（4）：981-991.

［27］劉勝敏，楊志宏，孫曉波.沙鼠腦缺血模型特點及應用的研究進展［J］.中國實驗動物學報，2013，21（6）：79-83.

Research progress of alcohol intervention in cerebral ischemia animal models

LI Jin-cheng，ZHAO Hai-ping，LUO Yu-min
（Cerebrovascular Diseases Research Institute，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China）

Alcohol is closely related to the occurrence and prognosis of cerebral ischemia.Researches on the relationship between alcohol and cerebral ischemia using different animal models draw different conclusions.This paper summarizes the common alcohol intervention methods in making animal models of cerebral ischemia，and evaluates the advantages and disadvantages of these models to provide reference for the future research.

Alcohol；Cerebral ischemia；Stroke；Models，animal

R33

A

1671-7856（2015）04-0070-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.014

國家自然科學基金項目（81471340，81401090）。

李錦程（1991-），女，碩士生在讀，神經(jīng)病學專業(yè)。Email：lijinchengsmile@163.com。

羅玉敏，女，研究員，博士生導師，研究方向：腦血管病。Email：yumin111@ccmu.edu.cn。

2015-02-10