沈方方，章愛蓮，朱 雯，滕懿群

(嘉興市第二醫(yī)院，浙江 嘉興 314501)

川崎病免疫功能和炎癥因子檢測及臨床意義

沈方方，章愛蓮，朱 雯，滕懿群

(嘉興市第二醫(yī)院，浙江 嘉興 314501)

目的 分析川崎病免疫功能及炎癥因子，探討細胞免疫、體液免疫及炎癥因子在川崎病中的機制及臨床價值。方法 對56例川崎病患兒及50例健康對照組兒童測定免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、補體C3、補體C4水平，用流式細胞儀免疫熒光法檢測CD3+T細胞百分比(CD3+%)、CD4+T細胞百分比(CD4+%)、CD8+T細胞百分比(CD8+%)、CD4+/CD8+、CD19+T細胞百分比(CD19+%)、自然殺傷細胞百分比(NK%)。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)。統(tǒng)計學方法采用2個獨立樣本t檢驗。結果 56例川崎病與50例健康對照組比較，CD8+%明顯降低，CD4+/CD8+比值倒置、CD19+%明顯升高，NK%降低，IgG升高，均具有統(tǒng)計學意義(t值分別為5.31、6.12、4.65、5.51、2.13，均P<0.01)。18例患兒急性期TNF-α、IL-6、IL-10較恢復期明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為2.59、2.60、2.53，均P<0.05)。急性期TNF-α、IL-6、IL-10在合并有冠脈損害組較無冠脈損害組均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為4.13、2.77、6.11，均P<0.05)。結論 川崎病急性期存在細胞及體液免疫功能的紊亂，炎癥因子參與了川崎病的發(fā)病機制。尤其是冠脈損害的KD患兒炎癥因子顯著升高。

川崎??；淋巴細胞亞群；炎癥因子；腫瘤壞死因子α

川崎病(Kawasaki disease，KD)又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征，是一種急性、自限性的全身血管炎性疾病，1967年由日本Tomisaku Kawasaki首次報道。一般認為它是一種自身免疫性疾病[1]。但是對川崎病患者細胞免疫和體液免疫功能異常的研究還沒有一致的結論[2-3]。冠狀動脈病變是其最嚴重的并發(fā)癥，該病已逐漸取代風濕熱成為我國小兒后天性心臟病的主要原因之一。明確該病的病因對于KD的診斷、特異性治療及預防至關重要。KD的病因及發(fā)病機制目前仍不十分清晰。可能與以下因素有關，包括感染、遺傳易感、病毒以及細菌超抗原致病學說等。關于KD發(fā)病機制的研究，目前主要集中于發(fā)病急性期的免疫系統(tǒng)高度激活和(或)免疫功能紊亂導致的血管炎損害。但關于淋巴細胞亞群、免疫球蛋白及炎癥因子等在KD急性期改變的研究結論仍不一致[4-5]。本研究通過檢測免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、IgA、補體C3、C4，T細胞亞群、B細胞、自然殺傷細胞(NK)及炎癥因子白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)在KD急性期的變化，進一步探討免疫細胞、免疫球蛋白及免疫炎癥分子在KD發(fā)病機制中的作用，為臨床及時診斷、合理治療KD及預防冠狀動脈出現(xiàn)并發(fā)癥提供依據(jù)和指導。

1 資料和方法

1.1 一般資料

KD及冠狀動脈擴張的診斷參照《諸福棠實用兒科學》。收集2012年1月至2014年12月在嘉興市第二醫(yī)院確診為KD的臨床資料56例為KD組，同期門診健康體檢者50例為對照。兩組病例均簽署知情同意書，且通過院倫理委員會同意該項研究。KD患兒中男性患兒為35例，女性患兒21例，男女比例為1.67：1；年齡在4個月～13.5歲，平均年齡為4.2±1.6歲。無冠脈損害(non-CAL)組48例，合并冠脈損害(CAL)組8例。

1.2 研究方法

采集56例KD患兒及健康對照組50例，入院次日(所有均未開始使用IVIG及阿司匹林治療)靜脈血測定淋巴細胞亞群：流式細胞儀為BD(Becton and Dickinson Company)的FACS CantoII，采用四色熒光標記技術。取新鮮全血50μL與試劑混勻后，4℃下避光孵育20min，然后加入溶血素2mL，再室溫避光10min，待溶解紅細胞后加緩沖劑離心5min洗滌2次，最后棄上清液，上機進行流式檢測，用Diva軟件分析。外周血測定免疫球蛋白。

炎癥因子的測定：分別采集KD患兒18例(另2例治療過程中轉上級醫(yī)院)IVIG治療前，治療后1周(恢復期)及正常健康兒童20例為對照組靜脈血2mL，分離血清-80℃冰箱待用。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定TNF-α、IL-6、IL-10，試劑盒購于上海巧伊生物有限公司，美國thermo scientific全自動酶標儀分析結果。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有資料處理用SPSS 13.0軟件包進行分析，檢測結果以均值±標準差表示，經方差齊性檢驗后，采用2個獨立樣本t檢驗比較兩組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 淋巴細胞亞群比較

KD患兒CD8+細胞比例明顯降低，CD4+/CD8+比值倒置，CD19+比例明顯升高，NK比例降低，與對照組比較均有顯著性差異(均P<0.05)，見表1。

2.2 免疫球蛋白及補體比較

KD患兒IgG、C3較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

2.3 炎癥因子測定

TNF-α、IL-6、IL-10濃度在KD急性期、恢復期較對照組均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；IL-6在KD恢復期較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 KD急性期、恢復期與對照組TNF-α、IL-6、IL-10濃度比較(pg/mL)

Table 3 Comparison of TNF-α, IL-6 and IL-10 between KD acute phase, KD recovery phase and control group(pg/mL)

2.4 冠脈損害與無冠脈損害炎癥因子濃度比較

TNF-α、IL-6、IL-10濃度在合并有CAL患兒較non-CAL均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表4。

表4 CAL組與non-CAL組 TNF-α、IL-6、IL-10濃度比較(pg/mL)

Table 4 Comparison of TNF-α, IL-6 and IL-10 concentr￣ations between CAL group and non-CAL group(pg/mL)

3 討論

3.1 淋巴細胞在川崎病發(fā)病機制中的作用

KD的發(fā)病機制目前尚未闡明，目前研究主要集中于機體免疫失調以及由此導致的多系統(tǒng)炎癥性損傷[6-7]。T細胞異?；罨荎D免疫系統(tǒng)激活導致血管免疫損傷的始動環(huán)節(jié)和關鍵步驟。T淋巴細胞活化是體內特異性免疫應答的重要環(huán)節(jié)，在KD急性期和亞急性期，異常活化的T細胞和單核細胞釋放大量的細胞因子和炎性介質，如IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α等，損傷血管內皮細胞，損傷的內皮細胞又可能成為新抗原，刺激B細胞分泌自身抗體，從而使內皮細胞損害加重。淋巴細胞及其亞群在機體維持正常的免疫功能中有重要作用。CD4+細胞可以促進體液和細胞免疫，CD8+細胞則抑制其反應，正常情況下，CD4+/CD8+比值維持動態(tài)平衡，以保持機體免疫功能穩(wěn)定，如果T細胞總數(shù)或CD4+/CD8+比值發(fā)生改變，則引起細胞免疫功能失調，發(fā)生一系列的病理變化。因此CD4+與CD8+T細胞的平衡在抑制腫瘤、抗感染和自身免疫病中起著重要作用。B細胞通過識別抗原后分泌免疫球蛋白進而介導體液免疫。CD19抗原是B淋巴細胞表面的特異性抗原，CD19抗原表達的量能夠反映總B細胞。自然殺傷細胞對T、B細胞有協(xié)調作用，同時還能抑制B細胞的活化，調節(jié)抗體的產生。

本研究發(fā)現(xiàn)KD患兒CD8+細胞比例明顯降低，CD4+/CD8+比值倒置，CD19+比例明顯升高，NK比例降低，與對照組比較均有顯著性差異。提示KD急性期免疫失調，CD8+抑制細胞功能相對低下，從而導致CD4、CD8比例失衡，NK細胞比例降低，對B淋巴細胞的抑制作用減弱，B細胞功能亢進，IgG升高，從而參與全身多系統(tǒng)損傷。與丁艷等[4]研究結果相符。

淋巴細胞亞群及免疫球蛋白在KD無冠脈損害組及合并有冠脈損害組均無統(tǒng)計學意義。但筆者發(fā)現(xiàn)合并有冠脈損害組IgG水平明顯降低或明顯升高，提示合并有冠脈損害者其免疫系統(tǒng)更加紊亂。但本研究病例數(shù)較少，仍需進一步大樣本研究。

3.2 炎癥因子在川崎病發(fā)病機制中的作用

多種炎癥因子參與KD的發(fā)生發(fā)展[6]。IL-6主要由活化的單核巨噬細胞、成纖維細胞、T細胞等分泌，為一種促炎細胞因子，它可促進B細胞分化Ig的分泌和再次免疫應答，促進細胞毒性T淋巴細胞，協(xié)同Ig增強CTL中穿孔素基因表達，并增加T細胞IL-2產生和IL-2R表達。IL-10是具有多種生物學活性的細胞因子，它是T細胞介導免疫應答引起單核/巨噬細胞和淋巴細胞異?；罨?，激活B細胞后釋放出來的一種炎性反應抑制因子。受損血管內皮在其刺激下，誘導血液中活化的淋巴細胞，單核細胞及血小板向受損血管表面聚集，引起血管壁更深的免疫損傷。TNF-α：KD急性期血漿TNF-α水平顯著增高，作為一種主要的促炎性反應因子，高水平的TNF-α直接損傷血管內皮細胞，導致內皮功能失調甚至內皮細胞凋亡和壞死，使血管屏障作用嚴重破壞[8]。臨床研究已經證實KD急性期存在TNF-α、白細胞介素等致炎因子的升高，而且升高的程度與冠狀動脈瘤及以后冠狀動脈狹窄的形成有關[9]。Hui-Yuen等在動物實驗中證實了TNF-α是冠狀動脈損害形成的必要條件。

本研究發(fā)現(xiàn)KD患兒急性期TNF-α、IL-6、IL-10較恢復期及健康對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義。急性期TNF-α、IL-6、IL-10在合并有冠脈損害組較無冠脈損害組均明顯升高，有統(tǒng)計學意義，與既往研究相一致[5]。提示炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10在川崎病的發(fā)生發(fā)展中，尤其是CAL中有重要作用。因此，在川崎病的患兒中早期檢測上訴炎癥因子，為早期診斷及治療提供實驗室依據(jù)。

KD患兒存在免疫紊亂，多種炎癥因子參與KD的發(fā)展，而作為最活躍的致炎因子和炎癥因子，TNF-α受到越來越多研究者的關注。Hui-Yuen等在動物實驗中發(fā)現(xiàn)TNF-α在全身性的急性炎癥反應后局限至冠狀動脈，TNF-α可使冠狀動脈淋巴細胞募集，導致彈力纖維降解，血管壁受損，導致川崎病特征性CAL。由此推斷針對TNF-α的抗TNF-α治療可以減輕炎癥反應和保護冠狀動脈損傷。Son等[10]及Ohashi等[11]學者發(fā)現(xiàn)在靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)和甲潑尼龍抵抗的川崎病病例中使用抗TNF-α，如英夫利昔單抗有明顯臨床療效且是安全的。因此，應用抗TNF-α治療為IVIG無反映型川崎病的治療提供了新的前景。

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[專業(yè)責任編輯：肖延風]

Immune function and inflammatory factor examination and their clinical significances in Kawasaki disease

SHEN Fang-fang, ZHANG Ai-lian, ZHU Wen, TENG Yi-qun

(JiaxingSecondHospital,ZhejiangJiaxing314501,China)

Objective To analyze the immune function and inflammatory factors in Kawasaki disease (KD) and explore the pathological mechanism and clinical value of cellular immunity, humoral immunity and inflammatory factors in KD. Methods The serum IgG, IgM, IgA and C3, C4 levels were detected in 56 children with DK and 50 healthy controls. Flow cytometry was used to analyze the proportion of CD3+T (CD3+%), CD4+T (CD4+%), CD8+T (CD8+%), CD4+/CD8+, CD19+T (CD19+%) and NK (NK%). ELISA was used to detect TNF-α, IL-6 and IL-10. Independentt-testwas adopted to analyze data. Results Compared with 50 healthy controls, CD8+% decreased significantly, the ratio of CD4/CD8 inverted, CD19+% increased obviously, NK% declined and IgG rose in 56 cases of KD with statistical significance (tvalue was 5.31, 6.12, 4.65, 5.51 and 2.13, respectively, allP<0.01). In the acute phase, the levels of TNF-α, IL-6 and IL-10 were significantly higher than those in the recovery phase (tvalue was 2.59, 2.60 and 2.53, respectively, allP<0.05). In the coronary arterial lesion (CAL) subgroup, the levels of TNF-α, IL-6 and IL-10 were higher than those in the non-CAL subgroup, and the differences were significant (tvalue was 4.13, 2.77 and 6.11, respectively, allP<0.05). Conclusion The cellular immunity and humoral immunity disturbances occur in acute phase of KD, and inflammatory factors are important in the pathogenesis of the KD. KD cases with CAL have especially higher level of inflammatory factors.

Kawasaki disease (KD); lymphocyte subset; inflammatory factors; TNF-α

2015-02-16

嘉興市科技局資助項目(2012AY1071-12)

沈方方(1984-)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事兒童風濕免疫疾病診療工作。

滕懿群，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.029

R725

A

1673-5293(2015)06-1201-03