郭軍 李繼蓮 吳杰編譯

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

蜜蜂個體發(fā)育過程中特定腸道菌的形成

郭軍 李繼蓮 吳杰編譯

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

研究表明，成年工蜂體內(nèi)有一些特定的益生菌落，它們對蜜蜂健康起到了至關(guān)重要的作用。在這些菌群中，Beta、Firm-5和Gamma-1（BFG）是三種主要的種系型。采用實時定量PCR（qPCR）和熒光原位雜交（FISH microscopy）技術(shù)研究了這三種種系型在蜜蜂生活史中和不同腸道器官中的分布和豐富度。成年工蜂（出房后9～30天）包含大量的BFG菌落群系，而蜜囊和中腸中很少有這些菌群，但回腸和直腸中則包含95%以上的BFG菌落?；啬c中菌群分層分布，其中Beta和Gamma-1種系型占多數(shù)，填滿了腸道的縱行皺褶部位。采用16S rRNA基因的研究結(jié)果進(jìn)一步清楚地表明中腸、回腸和直腸菌群分布有所不同。與老齡工蜂相比，幼蟲和剛出房的工蜂幾乎不包含細(xì)菌，蜂糧中也缺少大多數(shù)的菌型。通過實驗檢測細(xì)菌傳播路線，表明新蜂可通過接觸老蜂、接觸蜂巢或通過子脾巢房獲得細(xì)菌，并且這些途徑的傳播方式也不一致。

1 引言

消化器官內(nèi)的微生物群落對動物健康有著很大的影響。盡管致病菌對蜜蜂健康有不良影響，但共生菌的存在可引起最初的免疫反應(yīng)，抵抗入侵的病原體，還能增加營養(yǎng)。腸道菌群隨著宿主環(huán)境、飲食和年齡而變化，在不同腸道位置也不斷變化。很多研究對腸道菌的研究只反映了單一的樣品，對腸道菌的時空變化動態(tài)的研究很少，也缺乏這方面的相關(guān)信息。

社會性昆蟲蜜蜂（Apismellifera）是世界范圍內(nèi)重要的授粉昆蟲，過去十年由于蜜蜂大量消失引起人們對蜜蜂健康的廣泛關(guān)注。在西方蜜蜂中，成年工蜂腸道內(nèi)棲息著9類特定的細(xì)菌種系，這些細(xì)菌占細(xì)菌總數(shù)的95%以上，這一結(jié)果的獲得是通過非培養(yǎng)的方法并在不同環(huán)境、不同地理位置和不同的宿主基因型等條件下反復(fù)實驗得來。這種基于非培養(yǎng)的方法對同一特定細(xì)菌類型的反復(fù)觀察表明腸道菌中的大部分成員通過蜂箱內(nèi)個體之間相互傳播，而不是從箱外環(huán)境中獲取。另外，這些觀察還表明共生關(guān)系對蜜蜂來說至關(guān)重要。截止目前，還沒有研究報道細(xì)菌具體在哪個腸道器官內(nèi)或腸道菌在蜜蜂個體發(fā)育中是如何變化的。由于西方蜜蜂（Apismellifera）這種社會性昆蟲復(fù)雜的發(fā)育和社會行為，導(dǎo)致其腸道菌經(jīng)歷了生理上和營養(yǎng)環(huán)境的變化。另外，成年蜜蜂腸道包括四個主要部分（蜜囊、中腸、回腸和直腸），并在食物分解代謝和吸收上提供了不同的功能，同時也在不同環(huán)境下提供了一些共生菌。成年工蜂在不同日齡階段執(zhí)行一些連續(xù)的任務(wù)，這使得它們可能面對不同的微生物。年輕的工蜂在箱內(nèi)哺育幼蟲，較老點的工蜂隨著蜜源的變化采集花粉和花蜜。與成年蜂相比，西方蜜蜂的幼蟲具有一個不連續(xù)的腸道，即前腸（蜜囊和中腸）和后腸（回腸和直腸）直到化蛹前才相連，并在此時才進(jìn)行第一次排泄。蜜蜂幼蟲生活在單一的一個巢房中，哺育蜂為幼蟲飼喂高營養(yǎng)的王漿和少量的花粉和蜂蜜。本研究中，將使用不依賴細(xì)菌培養(yǎng)的方法來列舉和形象化不同日齡和不同腸道器官部位的微生物，重點集中在蜜蜂（Apismellifera）腸道菌中的三個主要分類群的豐富度上。

2 材料和方法

2.1 采用qPCR估計細(xì)菌豐富度

樣本于2009年11月取自美國亞利桑那州圖森市（Tucson）的美國農(nóng)業(yè)部卡爾·海登（Carl Hayden）蜜蜂研究中心（USDA-CHBRC）的2群蜜蜂。為了獲得已知日齡的成年工蜂，選1脾封蓋子脾，抖掉成年蜜蜂，裝入籠中，放入溫度保持為34°C并具有一定濕度的恒溫培養(yǎng)箱（模擬箱內(nèi)條件），保持箱內(nèi)為黑暗環(huán)境，蜂群放入培養(yǎng)24 h。每群蜂分別取5只剛出房的工蜂(NEWs)（1日齡蜜蜂），同時采用Testor公司的標(biāo)記產(chǎn)品（Testor Corp.,Rockford,IL）對50只新出房的工蜂進(jìn)行標(biāo)記，然后放回原蜂群，讓這些工蜂自然成熟。隨后，在第9天和第30天分別采集到5只和3只標(biāo)記的工蜂。樣品存入75%酒精-20℃存儲。DNA提取時，對腸道器官（如蜜囊，中腸，回腸和直腸）進(jìn)行解剖并用無菌鑷子和解剖剪刀將這四部分分開。參考Martinson等方法進(jìn)行DNA提取和量化，將DNA稀釋至75 ng/μl進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR和定量PCR(qPCRs)。為驗證所提DNA具有足夠的質(zhì)量進(jìn)行PCR，采用引物efs599和efa923對A.mellifera的ef1α基因（elongation factor 1-alpha gene）的一段約600 bp的片段進(jìn)行擴(kuò)增作為對照。

從16S rRNA基因序列設(shè)計引物，擴(kuò)增出的產(chǎn)物片段約100～250bp，主要用于檢測在蜜蜂腸道菌中最能持續(xù)觀察到的和最豐富的三種細(xì)菌類群。這些特定的種系型（或種）在先前的研究中被提到，即Beta,Firm-5,和Gamma-1,使用BFG種系型作為這三類細(xì)菌類群的通稱，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并采用Oliver等文獻(xiàn)中的方法在Roche Lightcycler熒光定量擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)。

2.2 熒光原位雜交（FISH）的顯微檢測

從USDA-CHBRC（亞利桑那州圖森市，2010年8月）的同一蜂群中按以下四種日齡分組取樣，每組取2只:未封蓋的5日齡幼蟲、剛出房工蜂、哺育蜂和采集蜂。解剖成年蜂的消化器官病放置到一個濾紙條上以促進(jìn)樣品固定。將腸道組織固定在4%的多聚甲醛中2～3 h（成年腸道）或者室溫過夜（幼蟲），用1×PBS (phosphate-buffered saline，PBS，磷酸鹽緩沖鹽水)沖洗。樣品通過真空滲入（Tissue-Tek VIP tissue processor(Sakura Finetek USA Inc.,Torrance,CA)）嵌入石蠟，采用一次性刀片切掉5μm的部分組織安裝在Epic Plus slides上(Epic Scientific,Tualitin,OR)。根據(jù)細(xì)菌種系型的16S rRNA基因設(shè)計特定和專有的的FISH探針。在探針雜交前將切片放在60°C中孵化30min以熔化清除石蠟，然后在二甲苯中沖洗5 min，沖洗2次，隨后在95%和75%酒精中分別洗7min，最后在雙蒸水(ddH2O)中漂洗5min。

按照Daims等報道的方法同時開展探針雜交。采用共聚焦顯微鏡（Zeiss 510 Meta）觀察切片的光譜成像。采用上述方法，觀察各個組織在沒有探針情況下的自發(fā)熒光成像情況。觀察成年蜂樣品的各個器官和幼蟲中腸的兩個位置。

2.3 幼蟲中細(xì)菌的PCR診斷

為了確定幼蟲中細(xì)菌微生物群的存在與否及特性，采用通用引物和特異性引物對DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。樣本（3日齡幼蟲，5日齡幼蟲和新出房工蜂）采自位于美國馬里蘭州貝茨維爾（Beltsville）的美國農(nóng)業(yè)部蜜蜂研究實驗室（USDA-BRL），從2群健康群和1群感染歐幼?。∕elissococcus plutonius）的蜂群中取樣。其中健康蜂（5日齡幼蟲和哺育蜂）取自位于亞利桑那州的美國農(nóng)業(yè)部卡爾海登蜜蜂研究中心（USDA-CHBRC）以及耶魯大學(xué)西校區(qū)（耶魯大學(xué)，西漢文）。提取表面消毒過的蜜蜂幼蟲DNA，采用上文所述方法，利用真核生物ef1α引物對所提DNA進(jìn)行擴(kuò)增以驗證DNA質(zhì)量。利用27f-short和1507r通用引物擴(kuò)增細(xì)菌檢測細(xì)菌是否存在。采用通用引物產(chǎn)生擴(kuò)增子的樣本繼續(xù)用7對引物（已經(jīng)在蜜蜂上發(fā)現(xiàn)的腸道微生物群，即Alpha-1,Alpha-2.1,Alpha-2.2,Beta,Firm-4,Firm-5,和Gamma-1）擴(kuò)增特異性種系型（引物序列和反應(yīng)條件見文獻(xiàn)Martinson等(2012)）。所有的PCR擴(kuò)增檢測（1%瓊脂糖凝膠電泳,100 V,50min）都設(shè)置一個陽性對照（成年工蜂腸道DNA）和陰性對照（ddH2O）。

2.4 評估新出房工蜂特有微生物群的來源

為確定新出房工蜂的微生物群的來源，采用兩個籠子進(jìn)行實驗：巢框籠（能將帶有子脾和蜂糧的巢脾圍起來的籠子），杯狀籠子（將工蜂關(guān)入籠子，放入手工搜集的蜂糧）。在對杯狀籠子進(jìn)行分析時，將蛹后期的蜜蜂蛹從封蓋子脾中移出放入籠中并在34°C和高濕環(huán)境下培養(yǎng)（模擬蜂群環(huán)境），保證新出房工蜂并未與蜂箱環(huán)境或老年工蜂接觸（這種新出房的工蜂也用顏料標(biāo)記）。6只新出房的工蜂分別放入上述兩個籠子，每籠放3只（按照Evans等報道的方法制作）所有籠中提供1∶1滅菌糖水（0.25μm的過濾器過濾滅菌）和未加工的蜂糧讓其隨意進(jìn)食。在所有的籠類型中，允許蜜蜂在其中生存9天，之后放入95%酒精保存。在每天的檢查中，搜集在第9天前死亡的蜜蜂，將其放入95%的酒精中。提取DNA，采用隨后介紹的步驟中的引物進(jìn)行擴(kuò)增。

剛出房的工蜂在實驗室飼養(yǎng)、無哺育蜂哺育并飼喂未加工蜂糧的條件下，蜂糧被實驗性作為特色微生物群的來源。另外，兩個樣本的蜂糧，分別來自7個巢脾的巢房中的蜂糧混合物，對這些蜂糧DNA中特定種系型直接進(jìn)行PCR。實驗室飼養(yǎng)條件下，有3只哺育蜂（和NEWs同群采集的工蜂），飼喂未加工的蜂糧，這些老年工蜂被認(rèn)為是特定微生物的來源。評定是否這些哺育蜂將其腸道混合物添加到蜂糧中，可能引入特定微生物到實驗室飼養(yǎng)的新出房工蜂所在籠中。

為了評估蜂箱材料（如巢脾和子脾巢房的封蓋）在引入微生物中的能力，在實驗室中讓蜜蜂蛹在巢框籠中孵化，無成年工蜂。這些新出房的工蜂用油漆標(biāo)記，并用于巢框籠測定。為了評價/評估，特定微生物從蜂箱材料中對新出房工蜂的轉(zhuǎn)移作用，20只標(biāo)價的新出房工蜂被放置在巢框籠中。為了評定蜂箱材料和哺育蜂的聯(lián)合轉(zhuǎn)移微生物作用，20只新出房工蜂和20只老年哺育蜂（從同一群中采集，并標(biāo)記不同顏色）被放置在巢框籠中。

2.5 454焦磷酸測序法分析Apismellifera腸道細(xì)菌的組成

解剖3只9日齡和1只30日齡蜜蜂的特定腸道器官，提取DNA，按上述介紹的方法采用qPCR方法分析，并進(jìn)行454焦磷酸測序。采用通用引物926f和1492r從每一個樣品的16S rRNA基因中擴(kuò)增一段約～450 bp的部分序列。每一個樣品給定一個條形碼序列，按照Ochman等描述的方法進(jìn)行高通量測序反應(yīng)（454 FLX Titanium系統(tǒng)，羅氏應(yīng)用科學(xué)，印第安納波利斯）。測序完成后，采用QIIME（一個專門用于分析微生物高通量測序數(shù)據(jù)的多樣化統(tǒng)計軟件，如alpha及beta多樣性統(tǒng)計）進(jìn)行分析。原始454 output被分成樣品，移除條形碼和引物序列，為達(dá)到質(zhì)量和長度（最小質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25，保留序列在460～600 bp之間），對產(chǎn)生的序列進(jìn)行過濾。序列進(jìn)行去離子化，挑出97%的序列相似性分類操作單元（operational taxonomic units, OTUs）并進(jìn)行比對，移除不能正確比對的非細(xì)菌OTUs。Alpha多樣性獲得主要在Mothur軟件中獲得。將OTUs作為一種特性種系群進(jìn)行歸類，或者在GenBank中進(jìn)行Blastn搜索。采用R語言中的Gplots程序包的Heatmap.2程序展示一個樣品中頻＞0.05%OTUs，或者在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中采用Blastn比對Apismellifera的特征種系型。

（未完待續(xù)）