董 軻，王 希，龍 敏，王 琳，張惠中

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 臨床實驗與檢驗科，陜西 西安 710000)

腸道病毒EV71新型VLPs疫苗的制備及鑒定

董 軻，王 希，龍 敏，王 琳，張惠中

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 臨床實驗與檢驗科，陜西 西安 710000)

目的 制備腸道病毒71型(EV71)的新型病毒樣顆粒(VLPs)疫苗，為手足口病防治奠定基礎(chǔ)。方法 應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建外殼蛋白VP1融合基因cVP1，免疫細(xì)胞化學(xué)及Western Blot測定該融合基因在HeLa細(xì)胞表達(dá)情況；將cVP1克隆于桿狀病毒表達(dá)載體pFastbac1，應(yīng)用昆蟲細(xì)胞TN5制備重組桿狀病毒cVP1 rBV，再將此重組病毒與本室保存的gag rBV以不同MOI比例共感染昆蟲細(xì)胞TN5，得到含有VP1的重組嵌合病毒樣顆粒cVP1 VLPs，最后以Western Blot及電鏡進(jìn)行鑒定。結(jié)果 免疫細(xì)胞化學(xué)及Western Blot結(jié)果顯示構(gòu)建的融合基因cVP1可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并成功制備成cVP1 rBV，該重組桿狀病毒和gag rBV共感染昆蟲細(xì)胞制備的VLPs結(jié)構(gòu)完整。結(jié)論 成功制備了EV71的新型VLPs疫苗，為后續(xù)研究打下了基礎(chǔ)。

手足口病；腸道病毒71型；病毒樣顆粒；制備及鑒定

手足口病(hand, foot and mouse disease，HFMD)為一組腸道病毒引起的傳染性疾病，近年來在我國持續(xù)爆發(fā)，嚴(yán)重危害公眾健康并帶來巨大社會負(fù)擔(dān)。引發(fā)手足口病的腸道病毒包括A組柯薩奇病毒、?？刹《竞湍c道病毒71型等，其中腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)病毒感染是部分患者出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)嚴(yán)重并發(fā)癥并導(dǎo)致死亡的重要原因[1-2]。因此，應(yīng)用新的技術(shù)手段及策略，研發(fā)安全性更高、免疫保護(hù)性更強(qiáng)并利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的新型手足口病疫苗具有重要的理論及實際應(yīng)用意義。Foo等(2007年)研究顯示，EV71病毒抗原表位基本位于外殼蛋白VP1、VP2上，尤其VP1殼蛋白不僅與病毒的抗原性密切相關(guān)，而且還包含了病毒特異性中和表位，因此多種EV71疫苗的研究均以VP1為靶點。

病毒樣顆粒(virus like particles，VLPs)是某些病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞內(nèi)自行裝配成無核酸成分的病毒樣粒子，因不含病毒核酸成分(無感染性)、與野生型病毒殼蛋白空間結(jié)構(gòu)高度相似(高免疫原性)等特點，近年來已成為疫苗研發(fā)的熱點之一。SIV gag基因編碼的蛋白可自我裝配成核心顆粒，以出芽方式分泌到細(xì)胞外時獲得包膜及膜蛋白。研究表明，可利用gag的此特性將外源性的跨膜蛋白錨定在gag的包膜上獲得嵌合型VLPs[3]。本課題擬借助逆轉(zhuǎn)錄病毒gp41及gag蛋白結(jié)構(gòu)及作用關(guān)系特點，構(gòu)建新型EV71-VLPs疫苗，為EV71病毒的新型VLPs疫苗研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

含EV71-P1基因的重組質(zhì)粒EV71-P1-TV由本室構(gòu)建并保存；env-sf162-PCAGGs、SIV-gag-PCAGGs及重組桿狀病毒rBV gag均由美國EMORY大學(xué)Chinglai Yang教授饋贈；E.coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞、Cellfectin、S.N.A.P MidiPrep Kit均購自Invitrogen公司；昆蟲細(xì)胞TN5、子宮頸癌細(xì)胞系HeLa均為本室保存；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基SF900Ⅱ購自Gibco公司；T DNA Ligase、Taq DNA聚合酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；胎牛血清FBS購自Hyclone公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG和TCL發(fā)光劑購自Pierce公司。鼠源Gag抗體購自Abcam公司，EV71 VP1抗體購自Abnova公司。

1.2 方法

1.2.1 cVP1融合基因構(gòu)建

應(yīng)用PCR方法，以env-sf162-PCAGGs為模板獲得gp41的信號肽、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)基因片段，以EV71-P1-TV為模板獲得EV71病毒基因VP1區(qū)。進(jìn)而應(yīng)用重疊PCR構(gòu)建包括gp41的信號肽區(qū)、EV71 VP1、gp41的跨膜區(qū)(TM)和胞內(nèi)區(qū)(CT)的融合基因，如圖1所示，命名為cVP1，并克隆入真核表達(dá)載體PCAGGs中，獲得真核表達(dá)載體cVP1-PCAGGs。

圖1 cVP1結(jié)構(gòu)示意圖

Fig.1 Structure diagram of cVP1

1.2.2 Western Blot鑒定cVP1表達(dá)

培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，應(yīng)用Lipofectamine 2000TM轉(zhuǎn)染上述構(gòu)建好的真核表達(dá)載體，裂解細(xì)胞，測定蛋白濃度，行SDS凝膠電泳；應(yīng)用半干法轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉液封閉后，加入相應(yīng)的VP1抗體，4℃孵育過夜，充分洗滌后，加入HRP標(biāo)記的二抗，孵育1～2h后，充分洗滌，加Pierce ECL底物曝光。

1.2.3 組織化學(xué)染色鑒定融合蛋白表達(dá)

培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，利用Lipofectamine 2000TM轉(zhuǎn)染上述的真核表達(dá)載體cVP1-PCAGGs，并設(shè)置PCAGGs空載體為對照，制備細(xì)胞爬片，應(yīng)用4%多聚甲醛固定，H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，滴加5% BSA封閉液封閉，加入VP1抗體，4℃過夜，洗片后加HRP標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)，37℃反應(yīng)30min，洗滌后DAB顯色。顯微鏡觀察。

1.2.4 cVP1桿狀病毒rBV cVP1的制備

將上述構(gòu)建好的嵌合蛋白cVP1基因克隆于pFastBac1載體中，轉(zhuǎn)化DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，鋪板(培養(yǎng)板含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL慶大霉素、10μg/mL四環(huán)素、以及100μg/mL Bluo-gal和40ug/mL IPTG)，挑取白色菌落，應(yīng)用S.N.A.P MidiPrep Kit試劑盒提取、純化重組桿粒DNA，應(yīng)用Cellfectin試劑轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞TN5(具體方法參照試劑說明書)。28℃培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，5～6d后，6 000rpm 4℃離心30min，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。

1.2.5 cVP1病毒樣顆粒的制備及鑒定

將rBV cVP1與rBV gag以不同MOI比例感染TN5細(xì)胞；至病變細(xì)胞數(shù)>90%(感染后約72h)，收集全部細(xì)胞混懸液，6 000rpm 4℃離心30min，留取上清，Western Blot鑒定。磷鎢酸負(fù)染后，透射電鏡觀察制備好的VLPs形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2 實驗結(jié)果

2.1 融合蛋白cVP1表達(dá)鑒定

將構(gòu)建好的cVP1-PCAGGs表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，應(yīng)用VP1抗體作為一抗進(jìn)行Western Blot檢測，結(jié)果如圖2A所示，得到大小約為55kDa條帶，與預(yù)期大小相符，而空載體PCAGGs轉(zhuǎn)染未見目的條帶，說明該融合蛋白可在真核細(xì)胞中表達(dá)。同時我們應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測了cVP1-PCAGGs在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果如圖2B顯示，與空載體對照相比，該cVP1融合蛋白在HeLa細(xì)胞中高表達(dá)。

2.2 融合蛋白cVP1重組桿狀病毒rBV cVP1的獲得

將構(gòu)建好的嵌合蛋白cVP1基因克隆于pFastBac1載體中，轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組桿粒DNA，應(yīng)用Cellfectin試劑轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞TN5后，28℃培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，與正常細(xì)胞對照比較，轉(zhuǎn)染重組桿粒DNA的TN5細(xì)胞逐漸增大、腫脹，漸脫離貼壁培養(yǎng)狀態(tài)，如圖3所示。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即含重組病毒rBV cVP1。

2.3 融合蛋白cVP1病毒樣顆粒疫苗的獲得

將rBV cVP1與rBV gag以不同MOI比例共感染TN5細(xì)胞，至病變細(xì)胞數(shù)﹥90%(感染后約72 h)，收集全部細(xì)胞混懸液，離心后留取上清，行Western Blot鑒定，結(jié)果如圖4，VP1抗體及gag抗體均檢測到特異性條帶，其中以6:1、10:1比例感染的TN5細(xì)胞上清，能夠檢測到較高濃度的cVP1和gag。

2.4 電鏡鑒定融合蛋白cVP1病毒樣顆粒形態(tài)

用磷鎢酸負(fù)染后，透射電鏡觀察制備好的cVP1 VLPs形態(tài)結(jié)構(gòu)表明，視野中出現(xiàn)結(jié)構(gòu)完整的病毒樣顆粒，其直徑大小為100～110nm 與gag病毒樣顆粒直徑大小相似(直徑大小約110nm)，結(jié)果如圖5所示。表明本實驗設(shè)計的分泌型VLPs制備方式能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)完整的病毒樣顆粒。

3 討論

3.1 融合蛋白cVP1的構(gòu)建

腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科(Picorna￣radae)的腸道病毒屬(Enterovirus)，歸屬于人類腸道病毒A。該病毒為二十面體立體對稱的球形結(jié)構(gòu)，無包膜和突出，直徑約24～30 nm，核酸為單股正鏈RNA，由7400多個核苷酸組成，自5'端依次排列著5′非編碼區(qū)、1個開放閱讀框、3′非編碼區(qū)以及多聚腺苷酸尾。在病毒復(fù)制過程中，病毒RNA首先翻譯出一條完整長肽，進(jìn)而被自身蛋白酶識別并切割為P1、P2、P3等3條多肽；其中P1被再次酶解為VP4、VP2、VP3及VP1等4個結(jié)構(gòu)蛋白；在完整的病毒顆粒中，VP1、VP2及VP3結(jié)構(gòu)蛋白位于病毒的外殼表面，VP4結(jié)構(gòu)蛋白則位于內(nèi)側(cè)。研究表明，EV71病毒抗原表位基本位于殼蛋白VP1，VP2上[4-5]，因此本課題選擇VP1作為疫苗抗原研究靶點。gp41是SIV病毒包膜蛋白的一個亞單位，一般以三聚體形式存在，結(jié)構(gòu)分為膜外區(qū)，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，在本課題中，我們應(yīng)用gp41的信號肽、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)與EV71的VP1構(gòu)建融合基因cVP1，此融合基因可在真核細(xì)胞中高表達(dá)，并可定位于細(xì)胞膜表面，為后續(xù)研究打下了堅實基礎(chǔ)。

3.2 融合蛋白cVP1病毒樣顆粒疫苗的獲得及鑒定

早在1975年，保加利亞科學(xué)家就以氫氧化鋁為佐劑，福爾馬林滅活EV71病毒疫苗進(jìn)行了初步臨床試驗。在隨后的研究中，尤其近年來，隨著人們對手足口病毒進(jìn)一步認(rèn)識，不同實驗室嘗試了各種不同的針對該疾病的疫苗制備方法，包括滅活全病毒疫苗、減毒活疫苗、亞病毒顆粒及DNA疫苗等[6-7]，且取得了巨大進(jìn)展，但為了探索更安全、制備更簡便的EV71疫苗制備方法仍需大量研究要做。SIV病毒gag基因編碼的蛋白可被蛋白水解酶裂解成3個結(jié)構(gòu)蛋白，分別為基質(zhì)(MA)、衣殼蛋白(CA)及核衣殼蛋白(NC)，可自我裝配成核心顆粒，以出芽方式分泌到細(xì)胞外時獲得包膜及膜蛋白，在本實驗中，應(yīng)用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)同時在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)cVP1和gag蛋白，gag蛋白在自我組裝并出芽到胞外時，會與包膜上的cVP1融合蛋白形成嵌合型VLPs。該方法利用了gag蛋白出芽分泌特點，因此制備疫苗時不需裂解細(xì)胞，僅僅收集細(xì)胞培養(yǎng)上清即可獲得VLPs，為以后擴(kuò)大化生產(chǎn)并產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)，也為其他新型VLPs疫苗的研究提供了平臺。本課題在后續(xù)研究中，應(yīng)進(jìn)一步分析該疫苗的免疫原性，為動物實驗打下堅實基礎(chǔ)。

[1]李靜,魏興家,余永生.武漢陽邏地區(qū)2008至2012年手足口病流行特征分析[J].中國婦幼健康研究,2015,26(2):188-190.

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[專業(yè)責(zé)任編輯：王寶西]

堅持哺乳可預(yù)防母嬰糖尿病發(fā)病

來自加拿大的一項最新研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行母乳喂養(yǎng)能夠幫助降低母親以及孩子患糖尿病的風(fēng)險。最近，來自加拿大Manitoba大學(xué)的研究團(tuán)隊找到了母乳喂養(yǎng)與Ⅱ型糖尿病發(fā)病率之間的關(guān)系。他們在24年時間里總共研究了來自Manitoba地區(qū)的334 553位孕產(chǎn)婦，其中有60 088位是生活在這一“孕期糖尿病”發(fā)病率超高地區(qū)的本地人，相比于來自外地的孕婦，她們的孕期糖尿病發(fā)病率高達(dá)2～3倍。而眾所周知的事實是，孕期糖尿病癥狀很有可能會引發(fā)母親與后代子女的Ⅱ型糖尿病。通過統(tǒng)計分析，她們發(fā)現(xiàn)本地的孕婦母乳喂養(yǎng)比例為56%，而外地孕婦母乳喂養(yǎng)的比例可達(dá)到83%。

那么如何才能降低糖尿病的發(fā)病風(fēng)險呢？研究者們指出，堅持母乳喂養(yǎng)能夠伴隨下列結(jié)果的發(fā)生：對于本地母親來說，能夠降低14%患Ⅱ型糖尿病的幾率；對于非本地女性來說，能夠降低23%的患糖尿病幾率；對于孩子來說(不論是否本地人)，都將降低18%患糖尿病的風(fēng)險。這一結(jié)果與其它因素，包括：孕期糖尿病、孕期高血壓、家庭收入、居住地、孕婦年齡以及嬰兒體重等都沒有相關(guān)性。

新的證據(jù)表明，堅持母乳喂養(yǎng)有益于預(yù)防糖尿病的發(fā)生。

Preparation and identification of novel VLPs vaccine against Enterovirus 71

DONG Ke, WANG Xi, LONG Min, WANG Lin, ZHANG Hui-zhong

(DepartmentofMedicalLaboratoryandResearchCenter,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710000,China；)

Objective To prepare a novel VLPs vaccine against Enterovirus 71 (EV71), so as to lay foundation for treatment of hand, foot and mouth disease (HFMD). Methods Molecular cloning methods was used to construct cVP1 gene, and the fusion gene expression in HeLa cells was tested using immunocytochemistry and Western Blot. Then cVP1 was cloned into pFastbac1 vector, and cVP1 recombinant baculovirus (cVP1 rBV) was obtained using insect cells TN5. After that cVP1 rBV and gag rBV were co-infected into insect cell TN5 in varied MOI ratios to gain cVP1 virus like particles (VLPs) with VP1 protein. These novel VLPs were identified by Western Blot and electron microscope. Results Immunocytochemistry and Western Blot results showed that cVP1 gene could be expressed in eukaryotic cells, and cVP1 VLPs were obtained by insect cells co-infected with cVP1 rBV and gag rBV. These novel VLPs had complete structure. Conclusion Novel VLPs vaccine based on EV71 are constructed successfully, which lays foundation for the following study.

hand, foot and mouse disease (HFMD); Enterovirus 71 (EV71); virus like particles (VLPs); preparation and identification

2015-11-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81572974)；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃資助項目(No.2013Jz010)

董 軻(1971-)，男，副教授，博士，主要從事疫苗的研究。

張惠中，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.06.006

R512.5

A

1673-5293(2015)06-1125-03