洪建芬，陸月平，張翔珍

(浙江省樂清市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 樂清 325608)

iNKT細胞在自發(fā)性早產(chǎn)發(fā)動機制中的作用研究

洪建芬，陸月平，張翔珍

(浙江省樂清市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 樂清 325608)

目的 探討恒定型自然殺傷T細胞(iNKT)在自發(fā)性早產(chǎn)發(fā)動中的作用。方法 選擇自發(fā)性早產(chǎn)孕婦40例(早產(chǎn)組)和正常孕婦40例(對照組)。采用流式細胞術(shù)檢測蛻膜組織中iNKT細胞和自然殺傷(NK)細胞的表達；采用RT-PCR法檢測穿孔素(perforin)mRNA的表達。結(jié)果 早產(chǎn)組蛻膜組織中iNKT細胞和NK細胞的百分比分別為(1.05±0.29)%和(24.21±9.32)%，均顯著高于對照組iNKT細胞(0.48±0.17)%和NK細胞(14.97±6.05)%的百分比(t值分別為2.267和2.094，均P<0.05)；經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析顯示，早產(chǎn)組iNKT細胞和NK細胞呈明顯的正相關(guān)(r=0.634，P<0.05)；RT-PCR結(jié)果顯示，早產(chǎn)組穿孔素mRNA的表達也顯著高于對照組(t=2.086，P<0.05)。結(jié)論 iNKT細胞可能通過產(chǎn)生穿孔素并促進NK細胞活化，參與自發(fā)性早產(chǎn)的免疫發(fā)病機制。

恒定型自然殺傷T細胞；自發(fā)性早產(chǎn)；免疫；作用機制

早產(chǎn)是常見的孕中晚期并發(fā)癥，其發(fā)生率占妊娠的5%～15%[1]。早產(chǎn)的病因和發(fā)病機制目前尚不清楚，以往的研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)感染、子宮病理性擴張、宮頸口松弛、蛻膜出血以及各種妊娠激素水平異常等因素均可參與早產(chǎn)的發(fā)生。近年來，越來越多的研究者認識到免疫系統(tǒng)的激活，特別是固有免疫的活化在早產(chǎn)發(fā)生中占有重要地位[2-3]。恒定型自然殺傷T細胞(invariant natural killer T-cells，iNKT)是一類存在于人類與小鼠蛻膜組織中重要的固有免疫細胞，可通過活化自然殺傷(NK)細胞，產(chǎn)生穿孔素(perforin)及其他免疫因子，發(fā)揮清除母-胎界面病原體的功能。2006年Boyson研究小組發(fā)現(xiàn)，iNKT細胞參與了早產(chǎn)的發(fā)病，但機理尚未明確。本研究主要通過檢測早產(chǎn)孕婦體內(nèi)iNKT細胞水平的變化，及下游免疫細胞NK細胞和穿孔素的變化，以探討iNKT細胞在早產(chǎn)發(fā)病中的免疫學(xué)作用，為臨床預(yù)防或早期診斷早產(chǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2012年6月至2014年6月在樂清市第二人民醫(yī)院產(chǎn)科經(jīng)陰道分娩的早產(chǎn)患者40例(胎膜早破23例，無胎膜早破17例)設(shè)為早產(chǎn)組，孕齡為30～36+6周，早產(chǎn)組孕婦入組標準：①無宮內(nèi)感染及合并絨毛膜羊膜炎；②無下生殖道或泌尿道感染；③未合并前置胎盤及胎盤早剝；④無其他明確可引致早產(chǎn)的因素。另隨機選擇同期在本院正常經(jīng)陰道分娩的足月孕婦40例設(shè)為對照組，孕齡為37～41周。兩組孕婦均為初產(chǎn)婦，均為單胎、頭位，孕期血糖、血壓正常，無妊娠合并癥及內(nèi)外科并發(fā)癥，無免疫性疾病，無免疫性藥物治療史。早產(chǎn)組和對照組孕婦的平均年齡分別為(26.3±4.1)歲和(25.8±3.5)歲，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.245，P=0.271)。

1.2 標本的采集和單細胞懸液的制備

取兩組孕婦經(jīng)陰道娩出胎盤約1.0cm×1.0cm×1.0cm的蛻膜組織塊，冰生理鹽水洗凈血跡。剪取少部分組織予OCT(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋，液氮速凍，置-80℃存放，用于后續(xù)RT-PCR檢測。其余組織剪碎并經(jīng)50μm孔徑的尼龍網(wǎng)過濾后，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，加磷酸鹽緩沖液(PBS)離心洗滌后，以1×106/mL的濃度重懸細胞，送流式細胞檢驗。

1.3 流式細胞術(shù)

將調(diào)整好濃度的細胞懸液置于流式管內(nèi)，將熒光抗體PerCP-CD3、FITC-NK1.1、APC-CD56和PE-CD16(BD，美國)對細胞進行常規(guī)染色，4℃避光20min，洗去游離抗體后，100μL重懸，在流式細胞儀(LSR-Ⅱ，美國Beckman)下檢測并計數(shù)CD3+NK1.1+的NKT細胞和CD16+CD56+的NK細胞。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR

取50～75mg凍存的蛻膜組織置于研缽內(nèi)，以研棒將組織碾碎；嚴格按照RNA提取試劑盒(GIAGEN，德國)說明書的要求提取總RNA。一步法RT-PCR：反應(yīng)總體系為50μL，其中組織總RNA 2μL，10×PCR Buffer 5μL，50mmol/L MgSO41.5μL，10mmol/L dNTP 1μL，穿孔素和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上下游引物各0.5μL，莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水補足50μL。反應(yīng)條件：42℃ 30min，95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取擴增產(chǎn)物5μL在1.0%瓊脂糖凝膠中于120V下進行電泳檢測，并采用Biocapt凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進行分析。穿孔素上游引物：5'-ATC TCA CCT CAT GGG AAC C-3'；穿孔素下游引物：5'-CCA TTA ACG ACC TGC TGT TC-3'；GAPDH上游引物：5'-TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT G-3'；GAPDH下游引物：5'-TCC TTG GAG GCC ATG TAG G-3'。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組恒定型自然殺傷T細胞和自然殺傷細胞比較

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，早產(chǎn)組孕婦蛻膜中iNKT細胞和NK細胞均顯著高于對照組的正常妊娠孕婦，經(jīng)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。對早產(chǎn)組iNKT細胞和NK細胞行Spearman秩相關(guān)分析顯示，iNKT細胞和NK細胞呈明顯的正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)r=0.634，P<0.05。

2.2 兩組穿孔素的比較

經(jīng)RT-PCR檢測結(jié)果顯示，早產(chǎn)組孕婦蛻膜中穿孔素mRNA的(穿孔素/GAPDH)表達為9.537，明顯高于對照組正常孕婦的5.989，t=2.086，P<0.05，見圖1。

圖1 兩組穿孔素mRNA表達比較結(jié)果

Fig.1 Comparison of perforin mRNA expression between two groups

3 討論

3.1 早產(chǎn)與免疫

胎兒在母體子宮內(nèi)作為一種半同種異體移植物存在，妊娠期間胎兒不被母體免疫系統(tǒng)排斥的重要原因是母體免疫耐受的作用。母胎免疫耐受的實質(zhì)是母體免疫細胞對胎盤滋養(yǎng)細胞呈低或無反應(yīng)性，這種耐受一旦被打破，則可能誘發(fā)早產(chǎn)的發(fā)動。部分自發(fā)性早產(chǎn)與宮內(nèi)感染、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)，但也有部分自發(fā)性早產(chǎn)在臨床無明顯感染征象，在這些早產(chǎn)孕婦體內(nèi)，免疫系統(tǒng)的異常激活及功能紊亂在早產(chǎn)的發(fā)病機理中起著重要的作用。固有免疫細胞對早產(chǎn)的影響是21世紀以來較新的發(fā)現(xiàn)，而關(guān)于iNKT細胞是目前多數(shù)研究的焦點。

3.2 恒定型自然殺傷T細胞與免疫

NKT細胞最早由Fowlker等于1987年在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，之后于20世紀90年代末在人類免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)[4]。NKT細胞來源于胸腺，在體內(nèi)多種器官、組織中均有分布，如：肝臟、骨髓、脾、臍血等。該細胞亞群同時具有傳統(tǒng)T細胞和NK細胞的某些表型特征，其細胞表面既表達T細胞抗原受體(TCR)又表達NK1.1[5]。iNKT細胞被認為是經(jīng)典的NKT細胞，可識別由類似于I型主要組織相容性復(fù)合體(MHC-I)糖蛋白CDld提呈的鞘糖酯類抗原，發(fā)揮增強免疫反應(yīng)或抑制免疫反應(yīng)的雙向免疫調(diào)節(jié)功能，在抗腫瘤、抗感染、器官移植的抗排斥以及控制自身免疫性疾病的發(fā)展中起重要作用[6]。

3.3 恒定型自然殺傷T細胞與妊娠

iNKT細胞在妊娠的母體中也具有雙向免疫功能，其表現(xiàn)為iNKT細胞可以通過清除母-胎界面的病原體而起到維持妊娠的作用，但其在清除病原體時，活化的iNKT細胞又可通過直接產(chǎn)生穿孔素或間接活化NK細胞，影響內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)而導(dǎo)致流產(chǎn)或早產(chǎn)[7]。有研究顯示，妊娠早期的母體內(nèi)iNKT細胞比例升高，誘導(dǎo)Th細胞分泌多種細胞因子，促進血栓素酶的活化并作用于胎盤的滋養(yǎng)細胞，導(dǎo)致凝血而阻斷母胎血供；同時還可活化和吸引中性粒細胞攻擊胚胎和胎盤組織，引發(fā)流產(chǎn)[8]。Li等[9]發(fā)現(xiàn)，在小鼠動物模型中去除iNKT細胞后，其早產(chǎn)現(xiàn)象顯著降低。另有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)孕婦較正常妊娠婦女蛻膜iNKT細胞和NK細胞明顯增多；子癇前期孕婦外周血中NKT細胞比例及穿孔素表達增加[10]。本研究則發(fā)現(xiàn)，在早產(chǎn)孕婦蛻膜組織中，iNKT細胞和NK細胞的百分比、穿孔素mRNA均較正常妊娠孕婦明顯增加；而前述已有研究[7]證實iNKT細胞可以通過表達穿孔素直接殺傷細胞，也可通過活化NK細胞影響妊娠婦女的內(nèi)分泌系統(tǒng)。因此認為iNKT細胞是妊娠中的關(guān)鍵物質(zhì)，在早產(chǎn)孕婦體內(nèi)iNKT細胞數(shù)量的異常增加可能是導(dǎo)致早產(chǎn)發(fā)病的重要免疫因素；而iNKT細胞參與早產(chǎn)的發(fā)生是通過產(chǎn)生穿孔素和活化下游NK細胞來實現(xiàn)的。

總之，iNKT細胞是維持妊娠的一把雙刃劍，這類細胞在引起自發(fā)性早產(chǎn)的免疫機制中占有重要的地位，值得引起研究者及臨床醫(yī)生高度重視。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：韓 蓁]

Role of iNKT cells in the launch of spontaneous preterm labor

HONG Jian-fen, LU Yue-ping, ZHANG Xiang-zhen

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,SecondPeople’sHospitalofLeqing,ZhejiangLeqing325608,China)

Objective To investigate the role of invariant natural killer T-cells (iNKT) cells in the launch of spontaneous preterm labor. Methods Totally 40 preterm pregnant women (preterm group) and 40 normal pregnant women (control group) were selected. Flow cytometry was used to detect iNKT cells and NK cells in decidual tissue, and RT-PCR was used to detect the expression of perforin mRNA. Results The percentages of iNKT cells and NK cells in decidual tissue in the preterm group were (1.05±0.29)% and (24.21±9.32)%, respectively, which were significantly higher than those of iNKT cells (0.48±0.17)% and NK cells (14.97±6.05)% in the control group (tvalue was 2.267 and 2.094, respectively, bothP<0.05). Spearman rank correlation analysis showed that iNKT cells was positively related with NK cells in the preterm group (r=0.634,P<0.05). RT-PCR results revealed that the expression of perforin mRNA in the preterm group was significantly higher than that in the control group (t=2.086,P<0.05). Conclusion INKT cells may take part in the immune pathogenesis of spontaneous preterm labor through the production of perforin and the promotion of NK cell activation.

invariant natural killer T-cells (iNKT)；spontaneous preterm；immune；action mechanism

2015-01-06

洪建芬(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作。

張翔珍，副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.004

R714.21

A

1673-5293(2015)05-0920-02