王立芹，閆曉婷，于學(xué)文，褚 靜，李 靜，李 騰

(1.西安醫(yī)學(xué)院護理系，陜西 西安 710021；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

ICAM-1/LFA-1在早期自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中的表達

王立芹1，閆曉婷2，于學(xué)文3，褚 靜1，李 靜1，李 騰1

(1.西安醫(yī)學(xué)院護理系，陜西 西安 710021；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

目的 通過觀察細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)在早期自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中的表達，探討ICAM-1/LFA-1與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系。方法 采用免疫組化方法檢測33例早期自然流產(chǎn)患者和同期妊娠的30例健康婦女蛻膜組織中ICAM-1、LFA-1的表達，用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)雙標檢測二者關(guān)系并加以分析。結(jié)果 流產(chǎn)組患者蛻膜組織基質(zhì)細胞ICAM-1和LFA-1蛋白表達強度高于對照組(t=-3.632，P=0.001；t=-3.839，P=0.001)；流產(chǎn)組蛻膜腺體細胞ICAM-1和LFA-1蛋白表達強度明顯低于對照組(t=-2.613，P=0.013；t=-2.266，P=0.027)；共聚焦顯微鏡下ICAM-1和LFA-1在流產(chǎn)組和對照組的蛻膜組織均有大部分重疊表達，在蛻膜腺體細胞流產(chǎn)組比對照組重合表達明顯。結(jié)論 ICAM-1和LFA-1在早期自然流產(chǎn)患者蛻膜組織基質(zhì)細胞的高表達和腺體細胞的低表達可能與早期自然流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。

早期自然流產(chǎn)；細胞間黏附因子-1；淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1；免疫組織化學(xué)；激光掃描共聚焦顯微鏡；蛻膜

自然流產(chǎn)(spontaneous abortion，SA)是早期妊娠最常見的并發(fā)癥之一，發(fā)病率約占全部妊娠的10%～15%，多數(shù)為早期流產(chǎn)。生理妊娠類似于同種異體移植。母胎界面免疫微環(huán)境由蛻膜中的免疫細胞及其分泌的細胞因子組成，各細胞因子間相互作用構(gòu)成復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，一旦失衡，母體會對胚胎產(chǎn)生免疫排斥而導(dǎo)致妊娠失敗。細胞間黏附分子-1(intracellularadhesion molecule-1，ICAM-1)又名CD54，屬于免疫球蛋白超基因家族成員，與其配體淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1)結(jié)合可介導(dǎo)上皮細胞與淋巴細胞間的相互黏附、上皮細胞與單核巨噬細胞的黏附、參與細胞的分化發(fā)育、細胞介導(dǎo)的細胞毒作用、炎癥反應(yīng)等生理和病理作用。有研究提示，ICAM-1參與了調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的局部免疫作用[1-2]。Blois(2005年)、Yurdakan(2008年)研究認為ICAM-1有可能與自然流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。為了探討ICAM-1和LFA-1在早期自然流產(chǎn)中的作用，本研究采用免疫組化S-P法檢測早期自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中ICAM-1/LFA-1的表達，并用共聚焦顯微鏡檢測二者的表達和關(guān)系，為探討胚胎植入和流產(chǎn)發(fā)生的機制及防治自然流產(chǎn)提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

①流產(chǎn)組(SA組)：選擇在2009年9月至2010年4月之間在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院及西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診和病房就診停經(jīng)7～10周，出現(xiàn)陰道流血或/和下腹部疼痛，通過詳細的詢問病史與系統(tǒng)檢查，并經(jīng)婦科及B超檢查確診為宮內(nèi)孕，排除其他原因所致陰道流血及腹痛，診斷為自然流產(chǎn)的患者33例，年齡為24～38歲，平均年齡29.6±3.2歲，孕期為49～70天，平均孕期58.7±5.9天；②對照組：選擇同期妊娠，無異常孕產(chǎn)史，停經(jīng)7～10周并行人工流產(chǎn)術(shù)的健康婦女30例，本次妊娠經(jīng)過無異常，并經(jīng)B超提示胚胎發(fā)育正常，年齡為23～39歲，平均年齡28.1±3.4歲，孕期為49～70，平均孕期57.8±5.9天。兩組年齡及孕期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.154，P>0.05；t=0.327，P>0.05)。

1.2 主要試劑

鼠抗人ICAM-1抗體、兔抗人LFA-1抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；S-P免疫組化染色試劑盒購自美國ZYMED公司；Cy5標記的羊抗鼠抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔抗體購自美國Southern Biotech公司。

1.3 方法

1.3.1 標本采集

清宮或人工流產(chǎn)手術(shù)后取得絨毛和蛻膜組織立刻浸入生理鹽水中，漂洗干凈后濾紙沾干，置入40g/L多聚甲醛中固定2～6小時后，將組織置250g/L蔗糖溶液中過夜，沉底后-70℃中凍存。將制備好的組織標本于恒冷箱冰凍切片機上進行切片，厚度為10μm兩張(10μm是平均的細胞直徑，共聚焦顯微鏡檢測用)和5μm(免疫組化用)兩張，吹干后置-20℃冰凍待用。

1.3.2 免疫組化染色

采用免疫組化S-P法對實驗標本分批染色，按試劑盒說明書進行操作。磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline，PBS)代替一抗為陰性對照。經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素復(fù)染后封片，于48小時內(nèi)光鏡下閱片。先在低倍視野下(×200)選取細胞分布均勻的視野，再在高倍鏡下(×400)使用Q55OCW采集圖像，image-plus分析軟件對ICAM-1、LFA-1蛋白的染色強度進行半定量分析，進行光密度(optical delnsity，OD)縮寫的測定。每張切片的每類組織在高倍鏡下任取5個視野進行光密度值分析，計算其平均光密度值作為其染色強度。

1.3.3 共聚焦顯微鏡檢測

取切片厚度為10μm的冰凍切片正常山羊血清封閉，加1:100稀釋的鼠抗人ICAM-1抗體，37℃2小時；PBS(pH7.4)洗滌后滴加Cy5標記的羊抗鼠抗體，37℃30分鐘；PBS(pH7.4)洗滌后滴加1:100稀釋的兔抗人LFA-1抗體，PBS(pH7.4)洗滌后滴加異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的羊抗兔抗體，37℃30分鐘，PBS洗滌后甘油緩沖封片，置于激光共聚焦掃描顯微鏡(奧林巴斯 FluoView FV1000)下觀察。用于FITC的激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為535nm，激發(fā)出的熒光為綠色，用于Cy5的激發(fā)波長為543nm，發(fā)射波長為700nm，激發(fā)出的熒光為鮮紅色。若兩種待測物分布于細胞的同一位點，則可產(chǎn)生紅、綠兩種顏色的重疊色黃色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料用χ2或Fisher精確概率法、兩獨立樣本的非參數(shù)Mann-Whitney測試進行比較；兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組蛻膜組織中細胞間黏附分子-1表達強度的比較

流產(chǎn)組蛻膜基質(zhì)細胞ICAM-1表達強度明顯高于對照組(P=0.001<0.05)；流產(chǎn)組蛻膜腺體細胞ICAM-1表達強度明顯低于對照組(P=0.013<0.05)；血管內(nèi)皮細胞ICAM-1表達強度兩組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖1。

注：A為早期自然流產(chǎn)患者蛻膜組織 B為正常早孕婦女蛻膜組織ICAM-1的表達S-P(×400) ICAM-1的 表達S-P(×400)

圖1 早期自然產(chǎn)患者(A)和正常早期妊娠(B)蛻膜組織中ICAM-1的表達

Fig.1 Expressions of ICAM-1 in decidual tissues of women with early spontaneous abortion (A) and normal pregnant women (B)

2.2 兩組蛻膜組織中淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1表達強度的比較

流產(chǎn)組蛻膜基質(zhì)細胞LFA-1表達強度高于對照組(P=0.001<0.05)；流產(chǎn)組蛻膜腺體細胞LFA-1表達強度明顯低于對照組(P=0.027<0.05)；血管內(nèi)皮細胞LFA-1表達強度兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖2。

注：A為早期自然流產(chǎn)患者蛻膜組織 B為正常早孕婦女蛻膜組織ICAM-1的表達S-P(×400) ICAM-1的 表達S-P(×400)

圖2 早期自然流產(chǎn)患者(A)和正常早期妊娠(B)蛻膜組織中LFA-1表達

Fig.2 Expressions of LFA-1 in decidual tissues of women with early spontaneous abortion (A) and normal pregnant women (B)

2.3 蛻膜組織中細胞間黏附分子-1和淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1的熒光雙標共聚焦檢測情況

激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示，早期自然流產(chǎn)和正常早期妊娠的蛻膜組織細胞均有不同程度的ICAM-1(紅色)和LFA-1(綠色)表達。ICAM-1和LFA-1的表達主要位于細胞膜，部分位于細胞基質(zhì)，其陽性表達呈片狀、灶狀或單個彌散分布，彌漫著色。蛻膜組織的基質(zhì)細胞、腺體細胞和血管內(nèi)皮細胞均有大部分重合區(qū)域呈黃色表達。

兩組中蛻膜基質(zhì)細胞二者基本重合呈黃色；流產(chǎn)組腺體細胞基本重合呈黃色，但對照組LFA-1表達強度明顯比ICAM-1強，呈現(xiàn)綠色表達，見圖3。

圖3 早期自然流產(chǎn)患者(A)和正常早期妊娠(B)蛻膜組織中ICAM-1、LFA-1的表達(×400)

Fig.3 Expressions of ICAM-1 and LFA-1 in decidual tissues of women with early spontaneous abortion(A)and normal early pregnant women(B)(×400)

3 討論

3.1 細胞間黏附因子-1和淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1與妊娠的關(guān)系

生理妊娠類似于同種異體移植，在胚泡定位、黏著和穿透過程中，涉及激素、細胞因子、黏附分子之間的協(xié)同作用。ICAM-1作為黏附分子的一員，存在于許多細胞的表面和細胞基質(zhì)，包括子宮內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞和白細胞等，主要介導(dǎo)細胞與細胞間的黏附，其一方面介導(dǎo)細胞毒和炎癥反應(yīng)，另一方面發(fā)揮免疫作用，與配體LFA-1、Mac-1結(jié)合，啟動細胞黏附和活化，傳遞細胞間信息，參與免疫應(yīng)答，炎癥發(fā)生[3]，胚胎發(fā)育[4]，心血管疾病[5]，惡性腫瘤轉(zhuǎn)移[6]等一系列生理及病理過程。Burrows(1994年)研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1 mRNA在孕早期蛻膜和絨毛膜的血管內(nèi)皮細胞上都有表達。Peter(1994年)的組化實驗亦顯示，早孕人蛻膜淋巴細胞有大量ICAM-1表達。Defrere(2005年)研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細胞表達ICAM-1比基質(zhì)細胞強。Blois(2005年)、Tamblyn等[4]研究認為小鼠母胎界面ICAM-1/LFA-1結(jié)合可以引起炎性因子集聚導(dǎo)致流產(chǎn)，阻斷ICAM-1/LFA-1母胎界面免疫耐受性的恢復(fù)。有研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在子癇前期患者胎盤可溶性ICAM-1表達降低[7]，但是在胎盤絨毛炎表達增高[3,8]，說明ICAM-1在母胎界面的表達與妊娠的結(jié)局是有關(guān)系的。

3.2 細胞間黏附因子-1和淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1在早期自然流產(chǎn)蛻膜組織的表達

蛻膜是由多種細胞成分組成，蛻膜細胞及其分泌的細胞因子構(gòu)成了蛻膜免疫微環(huán)境中特殊的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，在保護胎兒生長發(fā)育，免受母體的免疫排斥中起著重要的作用。Blois(2005年)研究表明，有流產(chǎn)趨向的鼠子宮內(nèi)膜和基質(zhì)細胞中發(fā)現(xiàn)ICAM-1高表達，與本研究發(fā)現(xiàn)相似，即早期自然流產(chǎn)患者蛻膜組織的ICAM-1、LFA-1蛋白表達強度在基質(zhì)細胞高于正常早孕婦女。自然流產(chǎn)婦女蛻膜中Th1因子干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α等增加，可以激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和增殖作用蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路，從而上調(diào)內(nèi)皮ICAM-1和LFA-1表達，介導(dǎo)靜息淋巴細胞的活化及白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附和游走，不利于胚胎著床[9-10]。本研究亦發(fā)現(xiàn)早期自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中的ICAM-1、LFA-1在腺體細胞的表達均低于正常早孕婦女，說明了蛻膜腺體細胞生理水平的ICAM-1/LFA-1結(jié)合，在妊娠早期發(fā)揮著重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)ICAM-1和LFA-1在流產(chǎn)組和對照組蛻膜組織的基質(zhì)細胞、腺體細胞和血管內(nèi)皮細胞均有大部分重疊表達，但還有小部分不能重合，說明ICAM-1主要和受體LFA-1結(jié)合，除此之外，還存在其他受體結(jié)合途徑。但可以看出流產(chǎn)組腺體細胞ICAM-1/LFA-1基本重合，而對照組ICAM-1表達相對較弱，說明在流產(chǎn)婦女蛻膜腺體存在著異常的ICAM-1/LFA-1結(jié)合升高，具體機制還有待進一步研究。

[1]Lopes I M, Maganhin C C, Oliveira-Filho R M,etal.Histomorphometric analysis and markers of endometrial receptivity embryonic implantation in women with polycystic ovary syndrome during the treatment with progesterone[J].Reprod Sci,2014,21(7):930-938.

[2]Kim K H, Park J K, Choi Y W,etal.Hexane extract of aged black garlic reduces cell proliferation and attenuates the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in TNF-α-activated human endometrial stromal cells[J].Int J Mol Med,2013,32(1):67-78.

[3]Egal E S, Mariano F V, Blotta M H,etal.ICAM-1 expression on immune cells in chronic villitis[J].Placenta,2014,35(12):1021-1026.

[4]Tamblyn J A, Lissauer D M, Powell R,etal.The immunological basis of villitis of unknown etiology[J].Placenta,2013,34(10):846-855.

[6]YAN Jun-jie, JIANG Yin-hua, YE Min ,etal.The clinical value of lymphatic vessel density, intercellular adhesion molecule 1 and vascular cell adhesion molecule 1 expression in patients with oral tongue squamous cell carcinoma[J].J Cancer Res Ther,2014,10(Suppl):C125-C130.

[7]Hwang J H, Lee M J, Seok O S,etal.Cytokinone expressi in placenta-derived mesenchymal stem cells in patients with pre-eclampsia and normal pregnancies[J].Cytokine,2010,49(1):95-101.

[8]Labarrere C A, Bammerlin E, Hardin J W,etal.Intercellular adhesion molecule-1 expression in massive chronic intervillositis:implications for the invasion of maternal cells into fetal tissues[J].Placenta,2014,35(5):311-317.

[9]Rains J L, Jain S K.Effect of Hyperketonemia (Acetoacetate) on Nuclear Factor-κB and p38 Mitogen-Activated Protein Kinase Activation Mediated Intercellular Adhesion Molecule 1 Upregulation in Endothelial Cells[J].Metab Syndr Relat Disord,2015,13(2):71-77.

[10]Rains J L, Kanikarla-Marie P, Jain S K.Hyperketonemia induces upregulation of LFA-1 in monocytes, which is mediated by ROS and P38 MAPK activation[J].Can J Physiol Pharmacol,2012,90(12):1642-1646.

[專業(yè)責任編輯：張欣文]

Expressions of ICAM-1 and LFA-1 in decidual tissues of patients with early spontaneous abortion

WANG Li-qin1, YAN Xiao-ting2, YU Xue-wen3, CHU Jing1, LI Jing1, LI Teng1

(1.DepartmentofNursing,Xi’anMedicalCollege,ShaanxiXi’an710021,China;2.MedicalSchoolinXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China;3.FirstAffiliatedHospitalofMedicalSchoolinXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To explore the correlation of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) with early spontaneous abortion by observing the expressions of them in decidual tissues of patients with early spontaneous abortion. Methods The ICAM-1 and LFA-1 expressions in the decidual tissues of 33 women with early spontaneous abortion and 30 normal pregnant women were analyzed by S-P immunohistochemistry method, and the relationship between ICAM-1 and LFA-1 was detected by confocal laser scanning microscope (CLSM). Results In abortion group the expressive intensity of ICAM-1 and LFA-1 was significantly stronger in the decidual stromal cells (t=-3.632，P=0.001；t=-3.839，P=0.001) and weaker in the decidual glandular epithelial cells than in the control group (t=-2.613，P=0.013；t=-2.266，P=0.027). The ICAM-1 and LFA-1 expression in the decidual tissues overlapped under CLSM，and the overlapped expression of decidual glandular epithelial cells in abortion group was more obvious than in control group. Conclusion High expressions of ICAM-1 and LFA-1 in decidual stromal cells and low expressions of them in decidual glandular epithelial cells may be correlated with the occurrence of early spontaneous abortion.

early spontaneous abortion；intracellular adhesion molecule-1(ICAM-1)；lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1)；immunohistochemistry；confocal laser scanning microscope (CLSM)；decidua

2014-12-17

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81270697)；陜西省教育廳科研計劃資助項目(11jk0713)

王立芹(1974-)，女，副教授，碩士，主要從事優(yōu)生遺傳的臨床研究。

于學(xué)文，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.003

R714.21

A

1673-5293(2015)05-0917-03