■王二柱 朱 群 郭紅偉 常 娟 尹清強(qiáng)

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.駐馬店華中正大有限公司，河南駐馬店 463000）

隨著人們對畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)重視度不斷的提高，以及抗藥和耐藥型超級病菌的出現(xiàn)，許多國家已經(jīng)明文規(guī)定抗生素類添加劑的適用動物品種、適用階段、劑量、停藥期等，歐盟已于2006年禁止所有抗生素作為飼料添加劑在動物生產(chǎn)中應(yīng)用。為了尋找抗生素的替代品，研究人員已開發(fā)出了微生態(tài)制劑、酶制劑、寡聚糖、酸化劑、中草藥等產(chǎn)品[1-2]，但在生產(chǎn)實(shí)踐中抗生素的應(yīng)用仍然十分廣泛，為了達(dá)到較好的抑菌和促生產(chǎn)效果，甚至大劑量地使用抗生素，導(dǎo)致抗生素的濫用。為了降低抗生素的使用劑量，將抗生素替代品如微生態(tài)制劑等與抗生素配伍使用，以期獲得良好的抑菌和促生產(chǎn)效果。試驗(yàn)通過體外試驗(yàn)，研究了金霉素與四種益生菌配伍對致病性金黃色葡萄球菌生長的抑制作用，探討金霉素與微生態(tài)制劑的最佳配伍比例，旨在為金霉素與微生態(tài)制劑同時應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 金霉素與微生物

金霉素由駐馬店華中正大有限公司提供，其標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法如下：樣品置于干燥器中干燥12 h后，準(zhǔn)確稱取3 g樣品(精確到0.000 2 g)加0.1 mol/l鹽酸30 ml攪拌5 h后定容至50 ml，在無菌條件下用0.2 μm濾膜過濾，配制成9 000 U/ml的無菌金霉素溶液，然后通過不同梯度的稀釋，制備金霉素含量分別為75、150、200、300、400、500、600 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液。益生菌(枯草芽孢桿菌、布拉迪酵母、乳酪桿菌、糞腸球菌)和金黃色葡萄球菌均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 培養(yǎng)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基

胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，用蒸餾水定容至1 L，pH值為7.0～7.2，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。冷卻后按1%的接種量接種，37℃振蕩（150 r/min）培養(yǎng)48 h。

1.2.2 金黃色葡萄球菌鑒別培養(yǎng)基——抗生素Ⅱ號培養(yǎng)基

蛋白胨6 g、葡萄糖1 g、牛肉膏粉1.5 g、酵母浸粉6 g、瓊脂 12～15 g，定容至 1 L，pH 值為 6.5～6.6，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。

1.2.3 培養(yǎng)乳酪桿菌的MRS培養(yǎng)基

胰蛋白胨10 g、牛肉蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 ml、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸鈉2 g、硫酸鎂200 mg、硫酸錳50 mg，用蒸餾水定容至1 L，pH值為6.2～6.6，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。接種乳酸桿菌后，37℃靜止培養(yǎng)48 h。

1.2.4 培養(yǎng)酵母菌的YPD培養(yǎng)基

酵母浸提物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、用蒸餾水定容至1 L，pH值為7.0～7.2，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。接種酵母菌后，30℃振蕩（150 r/min）培養(yǎng)48 h。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合益生菌對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

采用四因素四水平的正交試驗(yàn)設(shè)計，先將單獨(dú)益生菌培養(yǎng)液用培養(yǎng)基稀釋至活菌數(shù)為1×108個/ml，然后按表1的體積比配制成復(fù)合益生菌制劑。將金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)液均勻地涂布在已加入抗生素Ⅱ號培養(yǎng)基的雙碟培養(yǎng)皿中，待其完全吸收后，放入牛津杯，向牛津杯中加入100 μl復(fù)合益生菌菌液，放于4℃吸收4 h，然后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個處理3個重復(fù)，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。

1.3.2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

由上一步試驗(yàn)選出的復(fù)合益生菌最優(yōu)組合，與一定量的金霉素混合，配制成含不同金霉素濃度的復(fù)合益生菌制劑。另外，以不同濃度的單一金霉素作為對照組，按1.3.1的試驗(yàn)方法測定抑菌圈直徑。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示，采用SAS 6.12統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合益生菌對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用(見表1)

表1 復(fù)合益生菌組合對金黃色葡萄球菌的抑制效果

由表1可知，枯草芽孢桿菌的最大k值為k4，酵母菌的最大k值為k1，乳酪桿菌的最大k值為k4，糞腸球菌的最大k值為k1，這表明復(fù)合益生菌抑制金黃色葡萄球菌的最佳配比為：枯草芽孢桿菌∶酵母菌∶乳酪桿菌∶糞腸球菌=4∶1∶4∶1（P＜0.05）。其R值的大小依次為：RC＞RA＞RD＞RB，即乳酪桿菌＞枯草芽孢桿菌＞糞腸球菌＞酵母菌,這表明復(fù)合益生菌中乳酪桿菌所占比例的變化對抑制金黃色葡萄球菌的影響最大，其次分別是枯草芽孢桿菌、酵母菌和糞腸球菌。

2.2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用(見表2)

表2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍對金黃色葡萄球菌的抑制效果

由表2可知，隨著金霉素濃度的提高，無論是單一金霉素還是金霉素與復(fù)合益生菌的配伍，其抑菌效果均表現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的趨勢。單獨(dú)復(fù)合益生菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用與200～300 mg/kg的金霉素抑制作用相當(dāng)。當(dāng)150 mg/kg金霉素與復(fù)合益生菌配合后，其抑菌效果與單獨(dú)400～500 mg/kg金霉素作用相當(dāng)；而當(dāng)200～300 mg/kg金霉素與復(fù)合益生菌配合后，其抑菌效果要優(yōu)于單獨(dú)600 mg/kg金霉素的作用。即低濃度金霉素與復(fù)合益生菌配合后，可以達(dá)到高濃度金霉素的抑菌效果。

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌抑制金黃色葡萄球菌的生長

益生菌是一種活菌制劑，當(dāng)其數(shù)量達(dá)到一定程度時，對宿主的健康有促進(jìn)作用[3]。目前，益生菌作為一種新型添加劑廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)和動物生產(chǎn)中[4-5]，它可以調(diào)整動物腸道的微生物菌群平衡，并產(chǎn)生一些抗菌性物質(zhì)來抑制病原菌的生長[6]。以往的研究表明，益生菌的抑菌活力在體外可通過牛津杯法進(jìn)行測定[7]，牛津杯中的抗菌物質(zhì)可以透過瓊脂來抑制表面病原菌的生長，抑菌圈越大，其抑菌活力越高。

本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計研究枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酪桿菌和糞腸球菌抑制金黃色葡萄球菌的生長，結(jié)果表明，乳酪桿菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用最大，其主要原因是乳酪桿菌能夠分泌乳酸、過氧化氫、細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)[8]。本研究得出的益生菌最佳配比為：枯草芽孢桿菌∶酵母菌∶乳酪桿菌∶糞腸球菌=4∶1∶4∶1，其抑菌能力可以達(dá)到200～300 mg/kg金霉素的抑菌作用，為抗生素的替代提供了參考。

3.2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍抑制金黃色葡萄球菌的生長

金霉素是一種廣譜抗菌劑，無論對致病菌還是有益菌都有一定程度的抑制作用。本研究結(jié)果表明，當(dāng)復(fù)合益生菌與75 mg/kg金霉素配伍后，其抑菌圈直徑與單獨(dú)復(fù)合益生菌相似。隨著金霉素配伍劑量的增大，抑菌圈直徑表現(xiàn)出逐漸增大的趨勢，且大于對應(yīng)劑量的單獨(dú)金霉素的抑菌能力，表明復(fù)合益生菌與金霉素配伍使用具有疊加抑菌效應(yīng)。白耀輝等(2011)[9]研究表明，將益生菌制劑與抗生素聯(lián)合應(yīng)用在規(guī)模化肉雞生產(chǎn)中可以顯著提高肉仔雞的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，改善胴體品質(zhì)，這表明益生菌與抗生素配伍使用是可行的，與本研究的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

本研究獲得了四種益生菌抑制金黃色葡萄球菌生長的最佳配伍比例為：枯草芽孢桿菌∶酵母菌∶乳酪桿菌∶糞腸球菌=4∶1∶4∶1，該復(fù)合益生菌的抑菌能力與200～300 mg/kg金霉素的抑菌能力相當(dāng)。當(dāng)150 mg/kg金霉素與益生菌配合后，其抑菌能力與單獨(dú)400～500 mg/kg金霉素抑菌能力相當(dāng)，即低濃度金霉素與復(fù)合益生菌配合后，可以達(dá)到高濃度金霉素的抑菌效果，因此可減少實(shí)際生產(chǎn)中抗生素的用量。