■ 文遠(yuǎn)紅 黃燕華 王國霞 莫文艷 陳曉英 米海峰 曹俊明

（1.通威股份有限公司水產(chǎn)研究所，四川成都 610041；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，廣東廣州 510640；3.廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；4.廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640）

魚粉是水產(chǎn)飼料主要的蛋白源，但魚粉資源有限、價格高昂，其使用量近年來受到了限制。尋求魚粉替代源以達(dá)到降低飼料成本、提高經(jīng)濟(jì)效益成為國內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)。蠅蛆粉是常見的昆蟲資源，其蛋白質(zhì)、氨基酸含量高，維生素、礦物質(zhì)豐富，含有抗菌肽、殼聚糖等免疫活性物質(zhì)，是一種營養(yǎng)全面的蛋白源。已有研究表明，蠅蛆粉可替代非洲鯰魚（Clarias gariepinus）、黃鱔（Monopterus albus）、鯉魚（Cyprinus carpio）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）飼料中40%～100%的魚粉，不會對養(yǎng)殖動物生長性能、飼料利用率、血清生理生化指標(biāo)產(chǎn)生負(fù)面影響。消化酶是動物消化腺和消化系統(tǒng)分泌的具有消化水解食物中各營養(yǎng)素的酶類，在動物機(jī)體內(nèi)起著重要的作用。水產(chǎn)動物消化酶活性的研究是水產(chǎn)動物營養(yǎng)生理學(xué)和飼料學(xué)的主要研究內(nèi)容，消化酶活性的高低直接影響水產(chǎn)動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用和生長速度。腸道是水產(chǎn)動物主要的消化吸收部位，肝胰臟是水產(chǎn)動物最主要的消化腺，其組織結(jié)構(gòu)是否正常對動物的消化吸收能力有著重要的影響，也是認(rèn)識和探討水產(chǎn)動物消化吸收能力、機(jī)體健康狀況等生理學(xué)的基礎(chǔ)。因此，了解消化酶活性的高低和消化器官組織結(jié)構(gòu)的異常對于評價魚粉替代蛋白源具有重要的意義。

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）屬鯰形目、鲿科、黃顙魚屬，俗稱黃骨魚，屬溫水性底層魚類，其含肉率高、肉質(zhì)細(xì)嫩、無肌間刺、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，是我國常見淡水經(jīng)濟(jì)魚類，深受人們的喜愛，近年來在我國的養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大。目前，有關(guān)蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚抗氧化指標(biāo)、消化酶活性、腸道和肝胰臟組織結(jié)構(gòu)影響的研究尚未見報道。本文研究了蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚抗氧化指標(biāo)、消化酶活性、前腸和肝胰臟組織結(jié)構(gòu)的影響，以期為蠅蛆粉替代魚粉在黃顙魚飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)用蠅蛆干購買于河北省玉田縣某蠅蛆養(yǎng)殖場，飼養(yǎng)原料主要為麩皮，為鮮蠅蛆在自然條件下陰干所得。在實(shí)驗(yàn)室粉碎后過80目篩，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＝?jīng)分析測定，蠅蛆粉的水分、灰分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、總磷和鈣含量分別為（%風(fēng)干基礎(chǔ)）：8.2、10.8、53.0、13.5、1.1、1.0，能量為20.9 kJ/g。

以秘魯紅魚粉、豆粕、玉米蛋白粉為蛋白源，大豆油、魚油為脂肪源，高筋面粉為糖源配制對照組飼料，用蠅蛆粉等蛋白替代對照組飼料中20%、40%、60%、80%和100%的魚粉，配制5種試驗(yàn)飼料。6種飼料粗蛋白質(zhì)約為39.5%，總能約為16.8 kJ/g，其配方及營養(yǎng)成分見表1。飼料原料粉碎后過80目篩，逐級混勻，再加入魚油、豆油和水，混勻后用SLX-80型雙螺旋桿擠壓機(jī)將其制成直徑為2.0 mm的顆粒飼料，50℃烘干，自然冷卻裝入密封袋，保存于-20℃冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)魚與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用黃顙魚幼魚購于廣東省清遠(yuǎn)市黃沙漁業(yè)基地，購回后在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所水產(chǎn)研究室的室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴養(yǎng)2周，每天飽食投喂某商品黃顙魚0號料2次（08：00、17：00）。循環(huán)水系統(tǒng)由24個容量為350 L（直徑為80 cm，高70 cm）的圓柱形玻璃纖維缸組成。試驗(yàn)開始時，挑選出體格健壯、體表無傷、平均體質(zhì)量約為2.02 g的黃顙魚960尾，隨機(jī)分為6個處理組，每組4重復(fù)，每重復(fù)放養(yǎng)幼魚40尾，分別投喂6種配合飼料，記為G0、G20、G40、G60、G80和G100。每日飽食投飼3次（08：00、14：00和18：00），投飼量為體重的4%～6%，根據(jù)生長和攝食情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。每日記錄投飼量、死亡情況、水溫。光照為自然光源，全天24 h不間斷曝氣，水溫27.0～30 ℃，氨氮＜0.02 mg/l，亞硝酸＜0.05 mg/l，pH值7.3～8.0。飼養(yǎng)試驗(yàn)為期60 d。

表1 飼料配方及營養(yǎng)成分（干物質(zhì)）

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時，禁食24 h，每個重復(fù)取12尾魚，尾靜脈取血于抗凝管（BD公司）中混勻，于4℃4 000 r/min離心10 min，制備血漿樣品，-80℃保存，用于血漿相關(guān)指標(biāo)測定。每個重復(fù)取6尾魚，分離出胃、前腸、肝胰臟，用4℃預(yù)冷的生理鹽水將胃、腸道內(nèi)容物和肝胰臟血脂沖洗干凈，濾紙吸干后裝入離心管，于-80℃保存，用于黃顙魚消化酶活性及肝胰臟相關(guān)酶活指標(biāo)測定。每個重復(fù)取4尾魚，分離出前腸、肝胰臟置于Bouin氏試液中固定，室溫保存，用于前腸、肝胰臟組織切片制作。

1.3.2 血漿和肝胰臟丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性測定

血漿和肝胰臟丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，具體測定方法見試劑盒說明書。

1.3.3 消化酶活性測定

粗酶液制備：稱取一定量新鮮組織（胃、前腸、肝胰臟），濾紙吸干組織表面水分后用10倍生理鹽水（1 g組織∶9 ml生理鹽水）在冰水浴中勻漿，勻漿液在4℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清液為粗酶液。

消化酶活性的測定：①蛋白酶活性測定采用福林-酚試劑法。以1%酪蛋白作為底物，在660 nm波長處比色，測定吸光度值。蛋白酶活性定義為：每毫克組織蛋白在37℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個酶活性單位(U)。②淀粉酶活性的測定采用3,5-二硝基水楊酸顯色法。以2%可溶性淀粉溶液為底物，在540 nm波長處比色，測定吸光度值。淀粉酶活性定義為：每克組織蛋白在30℃條件下與底物作用30 min，每分鐘水解淀粉生成1 mg麥芽糖為一個酶活性單位(U)。③脂肪酶活性的測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，具體測定方法見試劑盒說明書。脂肪酶活性定義為：每克組織蛋白在37℃條件下與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為一個酶活性單位(U)。

1.3.4 前腸和肝胰臟組織結(jié)構(gòu)觀察

石蠟切片制作：取出用Bouin氏試液固定的組織，用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度為6 μm），40 ℃展片，蘇木素和伊紅（HE）染色，中性樹膠封片。

光鏡觀察：用光鏡（Nikon 80i）觀察前腸和肝胰臟組織切片，其中腸道切片放大倍數(shù)為100倍，肝胰臟切片放大倍數(shù)為200倍。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD,n=4）表示”。用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。先檢驗(yàn)數(shù)據(jù)方差齊性，若滿足方差齊性，進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA），差異顯著再作Tukey多重比較；若不滿足方差齊性，用Dunnett's T3檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚MDA含量和SOD活性的影響（見表2）

表2 蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚血漿、肝胰臟MDA含量和SOD活性的影響

由表2可知，G20～G100黃顙魚血漿MDA含量顯著低于G0（P＜0.05），但肝胰臟MDA含量不受蠅蛆粉替代水平的影響（P＞0.05）。與G0相比，G60～G100血漿SOD和G60肝胰臟SOD活性顯著升高（P＜0.05）。

2.2 蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚胃、前腸和肝胰臟蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性的影響（見表3）

表3 蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚胃、前腸和肝胰臟蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性的影響

如表3所示，G0和G40黃顙魚胃蛋白酶活性顯著高于其他各組（P＜0.05）；與G0相比，G20～G100前腸蛋白酶活性顯著升高（P＜0.05），G20～G100肝胰臟蛋白酶活性顯著降低（P＜0.05）。G20～G100胃脂肪酶、G60～G80前腸脂肪酶、G20肝胰臟脂肪酶活性顯著低于G0（P＜0.05），G100前腸脂肪酶、G40～G80肝胰臟脂肪酶活性顯著高于G0（P＜0.05）。黃顙魚胃淀粉酶活性不受蠅蛆粉替代水平的影響（P＞0.05）；與G0相比，G20～G100前腸淀粉酶、G40～G60肝胰臟淀粉酶活性顯著升高（P＜0.05）。

2.3 蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚前腸、肝胰臟組織結(jié)構(gòu)的影響

蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚前腸、肝胰臟組織結(jié)構(gòu)的影響如圖1、圖2所示。從圖1a～f可以看出，黃顙魚前腸組織結(jié)構(gòu)可分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層，黏膜突起形成皺襞（絨毛）。其中圖1 a～e前腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，紋狀緣發(fā)達(dá)，杯狀細(xì)胞較多，固有膜結(jié)締組織正常，前腸組織未發(fā)現(xiàn)病理損傷。但圖1 f前腸黏膜上皮細(xì)胞空泡變性，部分紋狀緣脫落，杯狀上皮細(xì)胞增生、固有膜結(jié)締組織疏松，出現(xiàn)病理損傷癥狀。從圖2 g可以看出黃顙魚肝胰臟肝小葉結(jié)構(gòu)不明顯，肝細(xì)胞呈索狀排列，未發(fā)現(xiàn)病理性損傷現(xiàn)象。觀察發(fā)現(xiàn)，圖2 h～l肝胰臟實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)受到破壞，肝細(xì)胞間充滿了脂肪粒，脂肪沉積隨蠅蛆粉替代魚粉比例的增加而逐步加重，形成明顯的脂肪肝，圖2 l最為明顯；其中G60組肝細(xì)胞受損破裂，出現(xiàn)出血性壞死灶等癥狀，其他圖中未發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞壞死現(xiàn)象。

3 討論

3.1 蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚抗氧化能力的影響

圖1 蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚前腸組織結(jié)構(gòu)的影響

圖2 蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚肝胰臟組織結(jié)構(gòu)的影響

MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用的產(chǎn)物，是反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)，也可間接反映機(jī)體細(xì)胞受損傷程度。SOD是機(jī)體內(nèi)有害物質(zhì)超氧陰離子自由基的天然清除劑，保護(hù)細(xì)胞膜免受自由基攻擊，活性高低可反映機(jī)體清除自由基的能力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)蠅蛆粉替代魚粉水平超過20%時，黃顙魚血漿和肝胰臟MDA含量出現(xiàn)不同程度的降低，G60～G100血漿SOD和G60肝胰臟SOD活性顯著升高，這在一定程度上提高了黃顙魚機(jī)體抗氧化能力；這與曹俊明等的研究結(jié)果不一致，其研究指出，當(dāng)家蠅蛆粉替代魚粉水平超過60%時，將使凡納濱對蝦機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)；這可能與凡納濱對蝦與黃顙魚屬不同兩種動物有關(guān)。Ogunji等報道，蠅蛆粉不會引起尼羅羅非魚機(jī)體生理應(yīng)激和氧化應(yīng)激效應(yīng)。本試驗(yàn)中，蠅蛆粉替代魚粉提高了黃顙魚機(jī)體抗氧化能力，這可能與蠅蛆粉含有抗菌肽、殼聚糖等免疫活性物質(zhì)能提高動物機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。張婷等報道，在黃羽肉仔雞飼料中添加0.5%家蠅幼蟲肽，可顯著提高仔雞的抗氧化能力和生長性能。

3.2 蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚消化酶活性的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，蠅蛆粉替代魚粉顯著影響黃顙魚胃、前腸和肝胰臟蛋白酶活性，這與楊帆的研究結(jié)果不同。楊帆的研究表明，當(dāng)蠅蛆粉替代魚粉比例低于50%時，胃、前腸、后腸和肝胰臟蛋白酶活性與對照組相比差異不顯著，當(dāng)替代比例繼續(xù)增加時，蛋白酶活性則顯著降低。出現(xiàn)這些差異的原因可能與養(yǎng)殖動物、蠅蛆粉來源、飼料蛋白質(zhì)含量及試驗(yàn)條件等因素有關(guān)。據(jù)報道，消化酶的分泌量、活性與消化系統(tǒng)和機(jī)體整體代謝水平相關(guān)。Debnath等報道，野鯪（Labeo rohita）蛋白酶活性隨飼料蛋白質(zhì)含量的增加而顯著升高。陳鵬飛等指出，丁鱥（Tinca tinca）腸和肝胰臟蛋白酶活性隨飼料中魚粉比例的增加而顯著升高。本試驗(yàn)飼料中蛋氨酸、賴氨酸等必需氨基酸含量隨蠅蛆粉替代魚粉比例上升而下降，其中蛋氨酸含量由0.91 g/100 g降至0.74 g/100 g，賴氨酸由2.82 g/100 g降至1.42 g/100 g。其含量不足可能影響胃、肝胰臟蛋白酶活性。蘇時萍等報道，黃粉蟲和蠶蛹粉必需氨基酸含量較低、組成不平衡，顯著影響黃顙魚肝胰臟、腸道和胃的蛋白酶活性。遲淑艷等指出，在低魚粉飼料中添加微膠囊蛋氨酸可提高凡納濱對蝦肝胰腺蛋白酶活性。蠅蛆粉殼聚糖含量較高，一般在11%左右，飼料中殼聚糖含量隨蠅蛆粉替代魚粉水平的增加而逐漸升高，可能影響了黃顙魚前腸蛋白酶活性。翟少偉等研究指出，在飼料中添加昆蟲殼聚糖可顯著提高鯽魚（Carassius auratus）腸道蛋白酶活性。

脂肪酶是一類酯鍵水解酶，能夠水解甘油酯、磷脂等脂類，脂肪在其作用下分解成甘油和脂肪酸。本試驗(yàn)中，各替代組黃顙魚胃、G60～G80前腸脂肪酶活性顯著降低，G40～G80肝胰臟脂肪酶顯著升高，這可能與飼料脂肪源、蠅蛆粉多不飽和脂肪酸含量較低有關(guān)。已有研究表明，魚類脂肪酶的分泌量受飼料脂肪含量和脂肪源的影響。郭占林等報道，不同脂肪源顯著影響紅螯光殼螯蝦（Cherax quadricarinatus）幼蝦肝胰腺脂肪酶活性，其中花生油組和豆油組脂肪酶活性最高，魚油組和豬油組脂肪酶活性最低。已有研究結(jié)果指出，水產(chǎn)動物對動物油的消化利用率低。本試驗(yàn)中替代組魚胃、G60～G80前腸脂肪酶活性顯著降低可能與蠅蛆粉油脂含量較高（13.45%）、黃顙魚對其的消化利用率較低有關(guān)；G40～G80肝胰臟脂肪酶活性顯著升高可能與肝胰臟是脂肪代謝主要器官和肝胰臟是魚類脂肪酶主要分泌器官有關(guān)。

淀粉酶是一類催化水解淀粉、降解碳水化合物的酶類，有利于水產(chǎn)動物對飼料碳水化合物的利用，淀粉酶活性與養(yǎng)殖動物、消化組織、飼料組成等因素有關(guān)。飼料碳水化合物（高筋面粉）含量隨蠅蛆粉替代魚粉比例的增加而逐漸降低（見表1），G20～G100組黃顙魚前腸淀粉酶、G40～G60組肝胰臟淀粉酶活性顯著增加。這說明黃顙魚淀粉酶活性對飼料淀粉含量的適應(yīng)程度較低，這與刺參（Apostichopus japonicus）、中國對蝦（Penaeus chinensis）腸道淀粉酶活性與飼料淀粉含量關(guān)系的結(jié)果較為一致。韓勃等指出，黑鯛（Hephaestus fuliginosus）腸道淀粉酶活性隨飼料碳水化合物含量的增加而逐步增加，但高含量（34%～42%）組間差異不顯著，其指出食物中淀粉會刺激腸道分泌淀粉酶，但這種調(diào)節(jié)作用有限。本試驗(yàn)中，前腸和肝胰臟淀粉酶活性不同程度升高，可能與飼料中蠅蛆粉殼聚糖含量逐漸增加有關(guān)。已有研究結(jié)果表明，昆蟲殼聚糖可顯著提高鯽魚腸道淀粉酶活性和異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）肝胰臟淀粉酶活性。

3.3 蠅蛆粉替代魚粉對黃顙魚前腸和肝胰臟組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道是魚類消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)重要的場所，其由黏膜層、黏膜下層、肌肉層和漿膜層構(gòu)成，其中黏膜層是消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵部位，腸上皮細(xì)胞是吸收營養(yǎng)素的主要細(xì)胞。腸道結(jié)構(gòu)完整性對魚類消化能力有著重要的影響。已有研究結(jié)果表明，養(yǎng)殖動物腸道上皮細(xì)胞脫落、上皮細(xì)胞核上空泡消失、黏膜皺襞固有層變寬、杯狀細(xì)胞數(shù)量增多等腸道正常形態(tài)結(jié)構(gòu)受到破壞后，將導(dǎo)致養(yǎng)殖動物對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力下降。本試驗(yàn)中，除100%替代組前腸皺襞上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，部分紋狀緣脫落等病理損傷外，其他組均未出現(xiàn)病理損傷，這說明蠅蛆粉替代魚粉水平不超過80%時，不會對黃顙魚腸道的完整性和形態(tài)結(jié)構(gòu)造成明顯損傷。關(guān)于損傷的原因，可能與G100飼料中精氨酸（2.16 g/100 g）和谷氨酰胺含量不足有關(guān)。林燕報道，谷氨酰胺可促進(jìn)建鯉幼魚腸道和腸細(xì)胞生長，提高皺襞高度。據(jù)報道，精氨酸能促進(jìn)新西蘭白兔腸上皮細(xì)胞增殖，維持腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的完整性。Sukhotnik等在研究精氨酸對大鼠腸道作用時指出，添加適量晶體精氨酸能夠提高腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖速度，促進(jìn)細(xì)胞分化，維護(hù)腸黏膜的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。

肝胰臟不僅是水生動物最主要的消化腺，也是功能最多的代謝器官，其是機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)代謝和解毒的中心，對外界應(yīng)激極為敏感。本試驗(yàn)中，黃顙魚肝胰臟脂肪變性隨蠅蛆粉替代水平的增加而加重，其中60%替代組肝細(xì)胞出現(xiàn)出血性損傷。隨著蠅蛆粉替代魚粉水平的增加，飼料中n-3系多不飽和脂肪酸含量逐漸降低(16.78%～1.79%)和n-3/n-6比值逐漸降低（0.57～0.08），當(dāng)蠅蛆粉高水平替代魚粉時，其含量不足或比值太低可能引起了黃顙魚肝胰臟組織結(jié)構(gòu)的異常。盧星明指出，黃鱔（Monopterus albus Zuiew）飼料中n-3系多不飽和脂肪酸缺乏或n-3/n-6比例太低容易引起脂肪在肝胰臟中沉積，形成脂肪肝，也容易導(dǎo)致黃鱔肝胰臟組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷。本試驗(yàn)中，G60肝細(xì)胞壞死，而G80～G100肝細(xì)胞未出現(xiàn)壞死，這是否與蠅蛆粉含有的抗菌肽、殼聚糖、凝聚素等活性物質(zhì)有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

蠅蛆粉部分替代魚粉可一定程度上提高黃顙魚抗氧化能力，對黃顙魚胃、前腸和肝胰臟消化酶活性均有一定影響（胃蛋白酶除外），對前腸和肝胰臟組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的損傷作用。根據(jù)黃顙魚抗氧化能力、消化酶活性和前腸、肝胰臟組織切片，建議蠅蛆粉替代魚粉水平不宜超過20%。

（參考文獻(xiàn)42篇，刊略，需者可函索）