何承誠 謝裕安 毛賽南 趙瑞強(qiáng) 閆 雷 黃 正

(廣西醫(yī)科大學(xué)1附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部，

2生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，南寧市 530021，E－mail:jake1976@163．com)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界第5大常見癌癥，是第三位的癌癥死因，全世界每年有75萬新發(fā)患者，大多數(shù)(＞80%)患者發(fā)生在撒哈拉沙漠以南的非洲和東亞地區(qū)，其中中國就有超過 50%的患者［1］。廣西扶綏縣是我國肝癌高發(fā)區(qū)之一，肝癌發(fā)病率高達(dá)52．79/10 萬人年［1－2］。肝癌的發(fā)病具有明顯的家族聚集傾向，遺傳因素在家族聚集性肝癌中具有重要作用［3］。王云等［4］提出軸突導(dǎo)向通路 CXCL12 基因與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有學(xué)者對(duì)北京漢族人群進(jìn)行研究，以最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)＞5%作為標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)多態(tài)性可能與肝癌的遺傳易感性有關(guān)［5］。還有很多學(xué)者的研究也認(rèn)為CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)具有較高研究價(jià)值［6－7］。本研究探討廣西扶綏縣壯族人群肝癌家系CXCL12基因rs3780891多態(tài)性與肝細(xì)胞癌遺傳易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 研究對(duì)象 采用對(duì)照研究方法，所有研究對(duì)象均來自具有相似暴露背景的肝癌高發(fā)區(qū)的廣西扶綏縣。肝癌家系組包括20個(gè)肝癌家系由肝癌患者及其直系親屬組成，其中肝癌患者20例，直系親屬59例，共79例。肝癌患者為2003年1月至2011年10月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院進(jìn)行外科手術(shù)的患者，術(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)診斷為HCC，術(shù)前未經(jīng)放射、化學(xué)或生物治療。直系親屬為與肝癌患者有直接血緣關(guān)系未患肝癌的一級(jí)親屬(包括父母、子女、兄弟姐妹)和二級(jí)親屬(包括叔伯、堂兄弟、堂姐妹)。經(jīng)病史采集顯示其直系親屬中至少有1人確診為肝癌。79例中，男45例，女34例，年齡16～86歲，中位年齡44歲;HbsAg(+)50例，HbsAg(－)29例;AFP(+)14例，AFP(－)65例;吸煙(≥10支/d)17例，不吸煙(＜10支/d)60例，飲酒 64例(≥100 g/d)，不飲酒(＜100 g/d)12例。正常對(duì)照組選擇在扶綏縣醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的人群，與肝癌家系組無血緣關(guān)系，體檢結(jié)果均健康，無肝炎病史、腫瘤病史及遺傳病史，共40例，其中男26例，女14例，年齡16～85歲，中位年齡47歲。吸煙15例，不吸煙(＜10支/d)25例，飲酒17例，不飲酒(＜100 g/d)23例。正常對(duì)照組與肝癌家系組間年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。本研究按照國家人類基因組研究倫理準(zhǔn)則進(jìn)行，所有入選者均簽知情同意書。

1．2 主要試劑及儀器 iPLEX反應(yīng)試劑(批號(hào):0000008607)、384－well SpectroCHIP 生物芯片(批號(hào):0000008596)、HOTSTART Taq 酶(批號(hào):14955500)、SAP酶(批號(hào):0000008616)、純化樹脂均購自Jena Bioscience公司;質(zhì)譜檢測儀和點(diǎn)樣儀購自美國Sequenom公司，GeneAmp?PCR System 9700購自美國Invitrogen公司。

1．3 DNA提取 用于分析CXCL12基因型的基因組DNA。采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的試劑盒，采用血液/細(xì)胞/組織DAN提取試劑盒提取。肝癌家系組中的20例肝癌患者取手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本提取;肝癌家系組中的59例直系親屬及40例正常對(duì)照組均采用靜脈血液標(biāo)本提取，提取DNA置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 CXCL12基因型分析 由深圳華大基因公司的SEQUENOM實(shí)驗(yàn)平臺(tái)采用美國SEQUENOM公司MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)對(duì)所有研究對(duì)象DNA的SNP的基因分型，采用TYPER4．0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲得分型數(shù)據(jù)。

1．4．1 引物設(shè)計(jì)及合成:使用Assay Designer 3．1軟件設(shè)計(jì)引物，由深圳華大基因公司合成，每個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)2條PCR擴(kuò)增引物和1條延伸引物，引物序列如下:CXCL12基 因 rs3780891:擴(kuò) 增 引 物 1－F:5'－CTGGCGATGTGTGTAGAA－3';擴(kuò)增引物 2－R:5'－CTGGCGATGTGTGTAGAG－3';延伸引物序列:5'－CTGGCGATGTGTGTAGA－3'。

1．4．2 SNP等位基因分析和單個(gè)基因型測定:使用熱啟動(dòng)Taq酶(Jena Bioscience公司，美國)，在384孔板上常規(guī)擴(kuò)增待測片段(40個(gè)循環(huán))，然后在PCR產(chǎn)物中加入2 μl堿性酸化酶(SAP，Sequenom)消化液(雙蒸水1．53 μl，HME 緩沖液 0．17 μl，SAP 0．474 U)，以除去未用盡dNTP，消化反應(yīng)為37℃ 60 min;85℃ 10 min。然后根據(jù)Sequenom程序進(jìn)行引物延伸反應(yīng)。用納升點(diǎn)樣儀(SpectroCHIP，Sequenom)，在 SpectroTYPER－RT 操作程序中，編輯相對(duì)應(yīng)的引物和樣本，并按順序讀取數(shù)據(jù)［9］。

1．4．3 飛行質(zhì)譜技術(shù)檢測 SNP位點(diǎn):采用 Sequenom MassARRAY平臺(tái)對(duì) CXCL12基因進(jìn)行 SNP分型，TYPER4．0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲得分型數(shù)據(jù)。根據(jù)引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物質(zhì)譜峰的位置確定其分子質(zhì)量，從而得出SNP分型結(jié)果;同時(shí)根據(jù)質(zhì)譜峰的信噪比、峰尖位置、峰寬度等參數(shù)判定高質(zhì)量 (conservative)、中等質(zhì)量(moderate)和低質(zhì)量(agressive)3種分型結(jié)果。同一種顏色可以對(duì)應(yīng)2個(gè)或3個(gè)峰值，分別為SNP位點(diǎn)的延伸引物峰及兩個(gè)等位基因峰，若該位點(diǎn)屬于純合子，則僅存在1個(gè)等位基因峰，若為雜合子，則存在2個(gè)等位基因峰［9］。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)法進(jìn)行對(duì)照組基因型分布的Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，判斷研究對(duì)象是否具有人群代表性。用χ2檢驗(yàn)和非條件logistic回歸分析法計(jì)算各種基因型的比值比(OR)及95%可信區(qū)間(95%CI)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 質(zhì)譜分析 CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)存在AA、GA、GG 3種基因型，其中AA基因型2例、GA基因型22例、GG基因型95例。見圖1。

圖1 CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)基因型分型圖

2．2 CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)基因型吻合度檢驗(yàn)

經(jīng)Hardy－Weinberg遺傳平衡定律進(jìn)行吻合度檢驗(yàn)，肝癌家系組、正常對(duì)照組人群中CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)基因型頻率與期望值吻合度較好(χ2=2．160，P=0．140;χ2=0．820，P=0．370)，符合 Hardy－Weinberg 遺傳平衡定律，表明具有良好的代表性。見表1。

表1 CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)基因型頻率吻合度檢驗(yàn)

2．3 CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)多態(tài)性與HCC的關(guān)系 正常對(duì)照組與肝癌家系肝癌組患者的 CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)GA基因型分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=0．75，95%CI=0．20 ～2．78，P=0．670);肝癌家系中直系親屬組與肝癌組的GA基因型分布頻率比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1．53，95%CI=0．41 ～5．77，P=0．529)。見表2。達(dá)的蛋白［10］。目前有研究表明CXCL12基因多態(tài)性對(duì)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、口腔癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥有顯著易感性［11－15］。CXCL12基因 rs180115位點(diǎn)多態(tài)性與腫瘤易感性有關(guān)，突變等位基因A攜帶者增加腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［16］。Brown 等［7］對(duì)CXCL12基因 rs3780891位點(diǎn)與Ⅰ型糖尿病易感性的關(guān)系進(jìn)行了研究。目前尚無CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)與肝癌遺傳易感性的研究報(bào)告，尤其在肝癌家族聚集性方面。

本研究首次探討CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)與廣西扶綏縣壯族人群肝癌家族的遺傳易感性的關(guān)系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組與肝癌家系肝癌組患者CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)GA基因型分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);肝癌家系中直系親屬組與肝癌組患者GA基因型的分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。說明CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)不是肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)位點(diǎn)。本次研究未發(fā)現(xiàn)CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)多態(tài)性與廣西扶綏縣壯族肝癌家族的遺傳易感性有關(guān)聯(lián)，其中原因可能是收集病例樣本量及對(duì)照樣本量太少。

總之，本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)多態(tài)性與家族聚集性HCC的遺傳易感性有關(guān)聯(lián)。這對(duì)于進(jìn)一步研究扶綏縣乃至其他地區(qū)肝癌高危人群的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提供了分子遺傳學(xué)依據(jù)，并對(duì)肝癌的預(yù)防具有一定的參考意義。

表2 各組CXCL12基因rs3780891位點(diǎn)的基因型分布及危險(xiǎn)度分析(n，%)

3 討論

肝癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤。有研究表明，HBV/HCV感染、黃曲霉毒 B1(aflatoxin B1，AFB1)攝入、飲水污染、不當(dāng)?shù)娘嬍沉?xí)慣等因素可能是肝癌的危險(xiǎn)因素［9］。但暴露于上述危險(xiǎn)因素的個(gè)體不一定都發(fā)生肝癌，這表明遺傳易感性的差異對(duì)個(gè)體肝癌發(fā)病有重要作用。CXCL12為基質(zhì)細(xì)胞源性因子－1(stromal cell－derived factor 1，SDF－1)基因3UTR第801位的G突變?yōu)锳后表

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