□ 楊 驊

轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是細(xì)胞內(nèi)信號蛋白的最大家族，在不同物種中，目前已發(fā)現(xiàn)TGF-β超家族轉(zhuǎn)化生長因子有40多種，而BMP15和GDF9均為上述家族成員之一。1993年Lee與同事共同確定了TGF-β家族中的新成員GDF9基因，并發(fā)現(xiàn)其在卵巢中高表達(dá)，而Mcgrath等在1995年進(jìn)一步證實(shí)GDF9基因在卵母細(xì)胞中高表達(dá)。Otsuka首次報(bào)道了BMP15基因在小鼠垂體組織中有表達(dá)，并揭示了在垂體組織中BMP15基因通過自分泌調(diào)控作用有選擇地促進(jìn)卵泡刺激素的合成。

近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)在一些物種睪丸組織中也有GDF9、BMP15基因的轉(zhuǎn)錄，提示這些生長因子會不會在調(diào)節(jié)雄性生殖功能方面也有著潛在作用。Peter G.Stanton則于2009年首次研究證明了在大鼠精子發(fā)生過程中 GDF9、BMP15基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)與定位，并且得出在體外GDF9蛋白可以抑制支持細(xì)胞緊密連接的功能和促進(jìn)抑制素B的產(chǎn)生。本文選擇小鼠作為研究對象，原因是國內(nèi)尚未有關(guān)于小鼠BMP15、GDF9基因在一個(gè)生精周期睪丸各時(shí)間點(diǎn)mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化的報(bào)道。

一、材料和方法

(一)實(shí)驗(yàn)動物及標(biāo)本采集。選用清潔級出生后3、9、15、21、28、35、56天雄性ICR小鼠以及雌性性成熟ICR小鼠，由南京醫(yī)科大學(xué)動物醫(yī)學(xué)中心提供，購于北京維通利華南京分公司。頸椎脫臼處死ICR雄性小鼠，“V”字形切口剪開皮膚，暴露胸腔、腹腔等，取出心、肝、脾、肺、腎、睪丸、附睪、垂體、下丘腦九種組織。雌性性成熟ICR小鼠取卵巢組織，步驟同上。

(二)儀器及試劑。MJ PTC-200型PCR擴(kuò)增儀(美國MJ公司);ABI7300熒光定量 PCR儀(美國 ABI公司);EP5604穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠);DYCP-31D水平電泳槽(北京六一儀器廠);FR-200紫外凝膠成像分析系統(tǒng)(上海醫(yī)用分析儀器廠)。提取組織總RNA的試劑:Trizol(Invitrogen，USA);DEPC(BioSharp，USA);氯仿、異丙醇(上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司，中國)?？俁NA反轉(zhuǎn)錄成cDNA試劑:dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、RNA酶抑制劑(Fermentas，USA)。PCR 檢測試劑:dNTP、Mg2+、buffer、TaqM(申能博彩，中國)。熒光定量PCR檢測試劑:SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，Japan)。

(三)PCR引物設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank中小鼠的BMP15和GDF9 cDNA序列，利用計(jì)算機(jī)軟件DNAstar，依照cDNA設(shè)計(jì)原則，序列如下:

BMP15:5’GAGCGAAAATGGTGAGGCTG3’，5’GGCGAAGACACTCCGTC3’，分子量 214bp。GDF9:5’GCTCTATAAGACGTATGCTACC3’，5’CAGAGTGTATAGCAAGACCGAT 3’，分子量342bp。

(四)PCR反應(yīng)參數(shù)。94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，60℃退火40秒，72℃延伸45℃，循環(huán)35次，72℃延伸10分鐘。

(五)RT-PCR反應(yīng)參數(shù)。50℃2分鐘;95℃10分鐘;95℃15秒，63℃1分鐘，40個(gè)循環(huán);95℃1分鐘，60℃30秒，95℃15秒。

二、結(jié)果

圖1 成年雄性小鼠各組織中BMP15基因的轉(zhuǎn)錄

(一)BMP15、GDF9基因轉(zhuǎn)錄的組織特異性。取成年雄性ICR小鼠，提取心、肝、脾、肺、腎、睪丸、附睪、垂體、下丘腦九種組織的RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，用 PCR技術(shù)分析各組織中BMP15、GDF9基因的轉(zhuǎn)錄情況，其中卵巢組織為陽參。結(jié)果顯示:BMP15基因在小鼠睪丸組織中有轉(zhuǎn)錄，此外在附睪和垂體中也有少量轉(zhuǎn)錄。GDF9基因僅在睪丸組織中有轉(zhuǎn)錄，其它組織中均未見轉(zhuǎn)錄。

圖2 成年雄性小鼠各組織中GDF9基因的轉(zhuǎn)錄

圖3 不同時(shí)期雄性小鼠睪丸中BMP15基因的轉(zhuǎn)錄水平

(二)睪丸BMP15、GDF9基因在睪丸不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄水平比較。選取出生后3、9、15、21、28、35天以及性成熟(8周以上)的雄性ICR小鼠睪丸，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。使用real time PCR的方法，以GAPDH基因作為內(nèi)參，對模板中BMP15、GDF9基因的原始拷貝數(shù)進(jìn)行半定量，以探明小鼠出生后一個(gè)生精周期睪丸各時(shí)間點(diǎn)BMP15、GDF9基因轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。結(jié)果顯示:出生后3天，睪丸組織中就有著極低水平BMP15基因的轉(zhuǎn)錄，但隨著睪丸的發(fā)育，轉(zhuǎn)錄水平有了一定程度的升高，但升高程度不顯著。GDF9基因在出生后3天，睪丸組織中同樣有著極低水平的轉(zhuǎn)錄，但伴隨著睪丸的發(fā)育，轉(zhuǎn)錄水平有了很大程度的升高，在28天達(dá)到峰值，并在此后保持穩(wěn)定。

圖4 不同時(shí)期雄性小鼠睪丸中GDF9基因的轉(zhuǎn)錄水平

三、討論

研究發(fā)現(xiàn)BMP15、GDF9基因并不僅在女性卵巢中有表達(dá)，在某些物種的睪丸和垂體中也有BMP15和GDF9 mRNA的存在，提示這些因子在調(diào)節(jié)睪丸和垂體的功能方面有著潛在作用。本實(shí)驗(yàn)以性成熟雄性ICR小鼠作為研究對象，使用PCR的方法，發(fā)現(xiàn)BMP15基因在小鼠睪丸、附睪和垂體組織中均有轉(zhuǎn)錄，而GDF9基因僅在睪丸組織中有轉(zhuǎn)錄。使用real time PCR的方法，探討了BMP15、GDF9基因在睪丸中的轉(zhuǎn)錄水平隨著個(gè)體發(fā)育，尤其在出生后一個(gè)生精周期中的變化情況，其中GDF9基因轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)上升，在出生后28天達(dá)到高峰并持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，這一變化趨勢與之前Peter G.Stanton在大鼠中的報(bào)道情況比較吻合。今后還將利用原位雜交的方法對小鼠精子發(fā)生過程中GDF9、BMP15基因在轉(zhuǎn)錄水平的定位做進(jìn)一步的研究。

［1］Lin SJ，Lerch TF，Cook RW，Jardetzky TS，Woodruff TK 2006 The structural basis of TGF-beta，bone morphogenetic protein，and activin ligand binding.Reproduction 132:179～190

［2］Chapman HA 2004 Disorders of lung matrix remodeling.J Clin Invest 113:148～157

［3］Shariat SF，Kim JH，Andrews B，Kattan MW，Wheeler TM，Kim IY，Lerner SP，Slawin KM 2001 Preoperative plasma levels of transforming growth factor beta(1)strongly predict clinical outcome in patients with bladder carcinoma.Cancer 92:2985～2992

［4］Dovio A，Masera RG，Sartori ML，Racca S，Angeli A 2001 Autocrine up-regulation of glucocorticoid receptors by interleukin-6 in human osteoblast-like cells.Calcif Tissue Int 69:293～298

［5］Monkawa T，Hiromura K，Wolf G，Shankland SJ 2002 The hypertrophic effect of transforming growth factor-beta is reduced in the absence of cyclin-dependent kinase-inhibitors p21 and p27.J Am Soc Nephrol 13:1172～1178