朱雅寧 趙靜 尹春博（天津市動物疫病預(yù)防控制中心 300402）

淺談豬圓環(huán)病毒病的實驗室診斷技術(shù)

朱雅寧 趙靜 尹春博（天津市動物疫病預(yù)防控制中心 300402）

鑒于我國豬圓環(huán)病毒感染一直呈上升趨勢，已經(jīng)給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成相當(dāng)大的經(jīng)濟損失，為了加強對豬圓環(huán)病發(fā)病的監(jiān)測和控制，本文綜述了國內(nèi)外運用血清學(xué)和分子生物學(xué)方法檢測豬圓環(huán)病毒的成果，包括ELISA、C-ELISA、間接免疫熒光試驗、PCR、PCR-RFLP及ISH等，便于全面了解豬圓環(huán)病毒的診斷技術(shù)研究進展。

豬圓環(huán)病；血清學(xué)；分子生物學(xué)；檢測技術(shù)；方法

豬圓環(huán)病毒病（Porcine circovirus disease，PCVD），是由豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）感染引起的重要傳染病。PCV是1978年由德國學(xué)者Tischer等首次從豬腎傳代細(xì)胞系PK-15細(xì)胞（ATCC CCL31）中發(fā)現(xiàn)的，并將其命名為豬圓環(huán)病毒（PCV）。隨后，經(jīng)血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)在德國、加拿大、英國、美國等國的豬群中PCV抗體陽性率很高，其中，1997年加拿大學(xué)者Ellis，Clark等從加拿大西部患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬群中分離到一種新的病毒，該病毒類似于PK-15細(xì)胞來源的PCV，為便于區(qū)別，Allan等將其稱為PCV2型（Porcine circovirus disease 2，PCV2），而將以前從傳代細(xì)胞系 PK-15中分離獲得的 PCV稱為 1型（Porcine circovirus disease 1，PCV1）。PCV1和PCV2病毒基因組為單鏈DNA，大小分別為1759bp和1768bp；PCV1和PCV2核苷酸序列的同源性不高，但其基因組結(jié)構(gòu)相似。PCV1無致病性，廣泛存在于豬體內(nèi)和豬的傳代細(xì)胞系；而PCV2與豬的多種疾病綜合征相關(guān)。

目前，我們對PCV的診斷主要是先通過臨床癥狀結(jié)合病理變化進行初步判定，但確診還須經(jīng)實驗室檢驗，實驗室檢驗主要有血清學(xué)和分子生物學(xué)方法。

1 血清學(xué)檢測技術(shù)

血清學(xué)檢測技術(shù)主要應(yīng)用血清學(xué)方法檢測組織病料或培養(yǎng)物中的PCV，主要包括ELISA、C-ELISA及間接免疫熒光試驗等方法。

1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

2000年，朗洪武等用加拿大的PCV2克隆化特異性表達抗原、陽性血清、陰性血清，按常規(guī)ELISA法進行PMWS抗體的檢測，被檢血清1：400稀釋，陽性和陰性對照血清1：100稀釋，當(dāng)被檢樣品的OD值3倍于陽性對照OD值時判為陽性，否則為陰性，證明ELISA的靈敏度較高。

1.2 競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗（C-ELISA）

2000年，Walker等首次利用PCV1和PCV2特異性單克隆抗體建立了競爭ELISA（C-ELISA）方法來檢測PCV2抗體。他用細(xì)胞培養(yǎng)的PCV2作為抗原，用PCV2特異性單克隆抗體作為競爭試劑成功地建立了C-ELISA方法，并將該方法和間接免疫熒光方法相比較。檢測結(jié)果表明，C-ELISA方法的檢出率為 99.58%，而間接免疫熒光的檢出率僅為97.14%，說明該方法比免疫熒光方法更敏感，可用于PCV抗體的大規(guī)模監(jiān)測。

1.3 間接免疫熒光試驗（IFA）

IFA是一種比較特異的血清學(xué)方法，主要用于病毒分離效果的鑒定及檢測病變組織或豬源細(xì)胞PCV的感染情況，既可檢測群特異性抗原又可檢測型特異性抗原。

按Allan等報道的方法進行。將病料接種PK-15細(xì)胞或病變組織冰凍切片，丙酮固定，用兔抗高免血清與細(xì)胞培養(yǎng)物反應(yīng)，同時設(shè)非感染PCV的正常PK-15細(xì)胞或正常組織切片的對照，可對PCV進行檢測和定型。如鏡檢出現(xiàn)特異熒光則證明細(xì)胞中有PCV病毒存在，即為PCV陽性。IFA快速簡單，花費較少，應(yīng)用非常廣泛。

2 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

分子生物學(xué)檢測技術(shù)主要應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測組織病料或培養(yǎng)物中的病毒核酸，主要包括PCR、PCR-RFLP及ISH等方法。

2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）

2.1.1 常規(guī)PCR方法

設(shè)計一對PCV特異引物，直接從病料或細(xì)胞中擴增PCV特異的基因組片段，以達到特異檢測PCV感染的目的。

呂艷麗等根據(jù)PCV2的基因序列設(shè)計一對特異的PCR引物進行PCR檢測，建立了特異的PCR診斷方法。該方法可以檢測細(xì)胞和組織中的PCV2病毒核酸。

2.1.2 多重PCR（Multiplex PCR）

多重PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，它可以簡單、方便地同時檢測2種或2種以上的病毒DNA，即在同一反應(yīng)中加入多對引物，擴增多個目的基因片段。該方法方便、快捷，已廣泛用于醫(yī)學(xué)臨床，給疾病的快速診斷帶來了方便。

2001年，蘆銀華等根據(jù)發(fā)表的PCV基因序列，合成3條引物，建立了復(fù)合PCR法。在試驗中，他們在同一體系中用三條引物擴增出了PCV1和PCV2的DNA片段，從而達到了PCV擴增一次就可檢測鑒別PCV1和PCV2的目的。

2.2 PCR-限制性長度多態(tài)性（RFLP）分析方法

該法分兩步，首先進行PCR擴增，引物為PCV1與PCV2的共同引物；然后是用一定的限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行酶切，電泳觀察片段差異，從而確定PCV的類型（PCV1或PCV2）。

Fenaux等根據(jù)已有的PCV株的基因序列，建立了通用的PCR-RFLP分析方法，該法不但可以用PCV2的致病性研究，而且可以用來檢測不同地域的PCV2的感染情況。Hamel等借助于RFLP建立了可以分型的PCR診斷方法，很容易檢測PCV1和PCV2。他根據(jù)已發(fā)表的所有PCV基因組的保守序列設(shè)計引物，對PCV1和PCV2毒株的基因均擴增出了438bp的基因片段，這些片段經(jīng)RFLP分析很容易鑒定和區(qū)分PCV2毒株的基因型。

2.3 原位雜交實驗（ISH）

根據(jù)所用探針的特異性不同，可將ISH方法分為3類，包括同時檢測PCV但不能進行分型的ISH；可對PCV1和PCV2進行分型的ISH及檢測PCV2與PPV或PRRSV混合感染的ISH。

2000年，Nawagitgul根據(jù)PCV2的ORF1和ORF2的有義鏈和反義鏈合成了能區(qū)分PCV1和PCV2的核酸探針。在58℃下，ORF1反義鏈探針與感染細(xì)胞中PCV1和PCV2都雜交，而ORF2反義鏈探針與感染細(xì)胞中PCV2雜交，不與PCV1核酸雜交；ORF1和ORF2有義鏈只與PCV2核酸雜交。反義鏈探針產(chǎn)生的信號比有義鏈強，研究表明ORF1反義鏈探針適合檢測PCV1和PCV2；ORF2反義鏈探針可區(qū)分PCV1和PCV2。

3 討論

（1）生產(chǎn)中根據(jù)臨床癥狀和病理變化只可作出初步診斷，因豬群中普遍存在PCV2的抗體，單一的抗體陽性不能確診為陽性，確診必須依靠實驗室方法檢測出病毒的抗原或核酸。但檢測方法多種多樣，各有優(yōu)缺點，結(jié)果也不完全一致，實踐中可根據(jù)實際情況選用上述方法中的一種或兩種方法進行確診。

（2）2000年以來，我國PCV2感染一直呈上升趨勢，已經(jīng)給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成相當(dāng)大的經(jīng)濟損失。目前，對PCV2的發(fā)病機制和免疫機理目前還不清楚，而且未發(fā)現(xiàn)一種有效的消毒劑能徹底消滅PCV2病毒，沒有有效的疫苗可用于預(yù)防和治療PCV2造成的感染。因此，研究敏感、特異、適于大規(guī)模檢測的診斷方法和開展有效疫苗的研制是預(yù)防和控制該病的一個亟待解決的課題。

朱雅寧（1982.3-），女，大學(xué)本科，獸醫(yī)師，主要從事實驗室檢測工作。