馬艷榮（新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心 843000）

PCR技術(shù)在畜產(chǎn)品安全檢測中的應(yīng)用

馬艷榮（新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心 843000）

隨著世界經(jīng)濟(jì)全球化、貿(mào)易自由化和農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易的迅速發(fā)展，畜產(chǎn)品安全已成為事關(guān)人民健康和構(gòu)建和諧社會(huì)的重大戰(zhàn)略問題，及時(shí)、安全、準(zhǔn)確地檢測出農(nóng)產(chǎn)品中的病原微生物是農(nóng)產(chǎn)品安全檢測的重要內(nèi)容。隨著畜產(chǎn)品分析物質(zhì)的不斷微量和痕量化，畜產(chǎn)品基質(zhì)的不斷復(fù)雜化，僅使用傳統(tǒng)分析技術(shù)已難以解決所有的問題。

1 PCR在肉中致病微生物檢測的應(yīng)用

加強(qiáng)畜禽肉和水產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫，保證其食用安全，是預(yù)防食源性疾病暴發(fā)的重要途徑。PCR技術(shù)有快速、特異、敏感等特點(diǎn)，因而該技術(shù)在肉食品中致病菌的檢測方面具有很大的應(yīng)用潛力。部分常見食源性病原微生物的PCR檢測已有相應(yīng)的商品試劑盒出售。大量研究表明，PCR技術(shù)在對(duì)食品中病原微生物的確證試驗(yàn)方面與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比至少具有相同的靈敏度，而多數(shù)情況下則表現(xiàn)出更高的靈敏度，而且檢測周期大為縮短。建立熒光PCR方法、實(shí)時(shí)PCR方法、多重PCR等方法可簡便、快速、靈敏地實(shí)現(xiàn)對(duì)腸出血性大腸桿菌，單增李氏菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)菌學(xué)診斷快速、簡便、經(jīng)濟(jì)，有較大的應(yīng)用價(jià)值。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，多重PCR、標(biāo)記PCR、不對(duì)稱PCR等多種不同的PCR方法都被應(yīng)用于畜產(chǎn)品檢測中，它們的應(yīng)用使PCR技術(shù)擁有了更高的靈敏度和更短的周期。

2 PCR在鮮肉及肉制品肉的種屬來源鑒定的應(yīng)用

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)食品質(zhì)量與安全性的要求也越來越高，席卷歐洲 “馬肉風(fēng)波”、瘋牛病、禽流感等疾病的出現(xiàn)以及宗教、經(jīng)濟(jì)健康原因和市場監(jiān)管，都急需一種快速、準(zhǔn)確的檢測方法以對(duì)肉制品、寵物食品和肉骨粉等所含肉的成分進(jìn)行種屬鑒定。當(dāng)前，對(duì)研究者、消費(fèi)者、食品工業(yè)和政策制定者等各個(gè)方面來說，食品的真?zhèn)味际且粋€(gè)熱點(diǎn)問題，尤其是肉類工業(yè)。PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡便、快速高效等特點(diǎn)，在肉類摻假檢測方面具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。目前所采用的感官檢驗(yàn)和免疫學(xué)方法可鑒別生鮮肉的種屬，但對(duì)熱加工處理的肉類，由于其感官性狀、蛋白質(zhì)成分和其他免疫原性物質(zhì)被破壞而難以鑒別，因此熟肉種類與飼料中牛羊肉成分的種屬鑒別一直是亟待解決的難題。

動(dòng)物品種的鑒定方法主要從蛋白和核酸兩個(gè)層次進(jìn)行。以蛋白為基礎(chǔ)的方法主要包括十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS PAGE）等電聚焦電泳和免疫學(xué)方法。以核酸為基礎(chǔ)的方法包括物種特異引物多重PCR、熒光PCR、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）等。

20世紀(jì)80年代，國外開始對(duì)肉的種屬鑒定進(jìn)行研究，初期的研究對(duì)象主要是生豬肉和牛肉。采用的方法主要有DNA雜交、免疫擴(kuò)散和等電點(diǎn)聚焦等。這些方法中，DNA雜交和免疫擴(kuò)散靈敏度高。但DNA雜交試驗(yàn)方法復(fù)雜，耗時(shí)長；免疫擴(kuò)散不能夠檢測出有親緣關(guān)系的肉類品種，比如山羊與綿羊，水牛與普通黃牛。同時(shí)對(duì)經(jīng)過加工的制品檢測效果不佳；等電聚焦速度快，但靈敏度稍差，成本高，工作量大且不易準(zhǔn)確定量。

物種鑒定的關(guān)鍵因素是選擇合適的分析基因。肉類食品在加工過程中經(jīng)過加熱、高壓、輻射等處理后，DNA發(fā)生斷裂，提取的DNA減少。Arslan A研究證實(shí)，烹煮、烘烤、壓力處理、油煎等烹飪過的牛肉制品通過提取其線粒體中271bp的DNA片段，而后經(jīng)過PCR擴(kuò)增也可以鑒別出來，但是高溫的非水烹調(diào)肉可能用PCR無法檢測，因?yàn)楦邷厥谷馓蓟NA變性。

目前用于肉類食品成分鑒定的基因通常位于線粒體（mtDNA）上，包括細(xì)胞色素 b（Cytb）基因、12SrDNA、16SrDNA、D-loop基因等。T.Matsunaga等（1999）利用Cytb來設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因片段，并將山羊、雞、牛、綿羊、豬和馬的基因混合，正向引物（Forward primer）在Cytb的保守DNA序列上設(shè)計(jì)，反向引物（Reveserprimer）采用幾個(gè)物種各自特有的DNA序列來進(jìn)行多元PCR反應(yīng)，所得的擴(kuò)增片段可用于鑒別幾種物種。高琳（2008）等以動(dòng)物線粒體DNA中Cytb區(qū)段的保守序列為目的基因進(jìn)行PCR-RFLP，從6種生肉及7種加工肉制品中鑒別出豬源性和牛源性成分。所有樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增均產(chǎn)生359bp的片段。擴(kuò)增子采用Alu I限制性酶切所產(chǎn)生的片段差異可用于區(qū)分豬肉和牛肉。

肉骨粉是牲畜屠宰后其毛纖維、皮革、角質(zhì)、骨骼、臟器等非食用組織經(jīng)由高溫蒸煮后再揮干水分的成品，是重要的動(dòng)物蛋白飼料，在養(yǎng)殖領(lǐng)域使用極為廣泛。目前國內(nèi)外已經(jīng)建立了許多從飼料里鑒別動(dòng)物源性成分的方法，其中以PCR方法最為靈敏和準(zhǔn)確。李文靜等分別運(yùn)用特異性引物，針對(duì)牛、羊、豬和雞的線粒體基因中的某一片斷進(jìn)行擴(kuò)增，建立了鑒別四種動(dòng)物源性成分的PCR方法，用每種動(dòng)物的特異性引物跟其它動(dòng)物的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果沒有擴(kuò)增出非特異條帶，說明選用的牛的引物和自己設(shè)計(jì)的三種引物都具有特異性，檢出的牛肉骨粉的最低含量約為0.001%。證明該方法具有快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以作為鑒定肉骨粉種類的常規(guī)方法。

綜上所述，PCR方法以其快速、靈敏、操作簡單、節(jié)省費(fèi)用等特點(diǎn)逐漸成為質(zhì)檢部門檢測的主要方法，PCR方法尤為突出的優(yōu)點(diǎn)在于解決了傳統(tǒng)方法的困難，使致病微生物的檢測，熟肉、熟肉制品的種類鑒定成為可能，為市場肉類管理、動(dòng)物檢疫、刑偵等提供了快速、可靠、方便的手段。

馬艷榮（1981.1-），女，漢族，大學(xué)本科，獸醫(yī)師，從事獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測工作。