李雪，李棟紅，王小平，白吉慶

(陜西中醫(yī)學院，陜西 咸陽 712046)

·基礎研究·

獼猴桃藤總黃酮純化工藝研究△

李雪，李棟紅，王小平*，白吉慶

(陜西中醫(yī)學院，陜西 咸陽 712046)

目的：獼猴桃藤中總黃酮純化工藝的優(yōu)選。方法：采用單因素設計，以總黃酮的含量為評價指標。結果：最佳純化條件樣品與聚酰胺的比例為1∶10，10倍量柱體積的60%乙醇洗脫，所純化的總黃酮含量最高，可達51.8%。結論：該純化工藝簡單、可行，可用于獼猴桃藤中總黃酮的純化。

獼猴桃藤；總黃酮；純化工藝；正交設計

獼猴桃藤為獼猴桃科獼猴桃屬植物獼猴桃ActinidiaChinensisPlanch.的藤[1]。獼猴桃根具有清熱解毒、活血散結、祛風利濕之功能。臨床上用于治療胃癌、乳腺癌、風濕性關節(jié)炎、淋巴性結核、跌撲損傷、癰癤等病[2]。我國為獼猴桃的主要產區(qū)，陜西省廣泛栽培，栽植面積占全國60%以上。近年發(fā)現中華獼猴桃根富含黃酮類、生物堿類等成分，具有降壓、抗腫瘤等藥理作用[2-5]。獼猴桃根資源相對匱乏，但其藤因為果農每年都要修剪，資源非常豐富。前期研究發(fā)現獼猴桃藤富含大量黃酮類成分，但對其總黃酮純化工藝研究報道較少，因此本文對其總黃酮的純化工藝進行研究，希望為獼猴桃藤總黃酮的開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試劑、試藥

1.1 儀器

紫外-分光光度計(上海美普達儀器有限公司)；德國IKA RV10旋轉蒸發(fā)儀；KQ-300VDE型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DZF-6050B真空干燥箱(上海齊欣科學儀器有限公司)；101-2型電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；BT125D電子天平(賽多利斯)。

1.2 試劑、試藥

獼猴桃藤，經陜西中醫(yī)學院生藥教研室白吉慶副教授鑒定為獼猴桃科獼猴桃屬植物獼猴桃ActinidiaChinensisPlanch.的藤；蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號：100080-200707)；聚酰胺(100～200目)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 粗提物制備 稱取獼猴桃藤藤飲片150 g，用8倍量60%的乙醇提取3次，每次1 h，合并濾液，減壓回收乙醇至稠膏狀，減壓干燥，得粗提物14.64 g。

2.1.2 對照品的制備 精密稱取蘆丁對照品9.93 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 標準曲線的繪制

分別取蘆丁對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于10 mL容量瓶中，精密加入5%的亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min；加入4.3%的氫氧化鈉試液4 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白，用紫外-可見分光光度法，在500 nm波長處測吸收光度。以總黃酮(蘆丁計)濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線，得Y=0.008 73X-0.002 8(r=0.999 9)，總黃酮(蘆丁計)在0.01～0.08 mg·mL-1線性關系好良好[6]。

2.3 上柱溶液的制備

稱取粗提物適量置燒瓶中，精密加入10倍量60%的乙醇，稱定重量，超聲20 min，取出，室溫放置，稱重，用60%的乙醇補足減失的重量，過濾，濾液備用。

2.4 純化工藝考察

2.4.1 洗脫量的考察 取供試品2 g(平行3份)，精密稱定，按照2.3項下的方法制備上柱溶液，加到已處理好的聚酰胺(10 g)柱上(30 cm×5 cm)，分別用6、8、10、12倍量柱體積的60%乙醇洗脫，收集洗脫液，搖勻，精密量取0.3 mL置10 mL容量瓶中，照2.2項下的方法自加入5%的亞硝酸鈉0.4 mL起，依法測定吸光度。代入標準曲線，計算總黃酮的濃度。精密量取洗脫液適量，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷至室溫，精密稱重。計算所得純化物中總黃酮的含量分別為31.6%、40.5%、49.2%、42.8%。

2.4.2 洗脫濃度的考察 取供試品2 g(平行3份)，精密稱定，按照2.3項下的方法制備上柱溶液，加到已處理好的聚酰胺(10 g)柱上(30 cm×5 cm)，用10倍量柱體積的50%、60%、70%、80%乙醇洗脫，收集洗脫液，搖勻，精密量取0.3 mL置10 mL容量瓶中，照2.2項下的方法自加入5%的亞硝酸鈉0.4 mL起，依法測定吸光度。代入標準曲線，計算總黃酮的濃度。精密量取洗脫液適量，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷至室溫，精密稱重。計算所得純化物中總黃酮的含量分別為32.4%、48.6%、39.2%、40.6%。

2.4.3 上樣量的考察 分別取供試品1、2、3 g(平行3份)，精密稱定，按照2.3項下的方法制備上柱溶液，加到已處理好的聚酰胺(10 g)柱上(30 cm×5 cm)，分別用10倍量柱體積的60%乙醇洗脫，收集洗脫液，搖勻，精密量取0.3 mL置10 mL容量瓶中，照2.2項下的方法自加入5%的亞硝酸鈉0.4 mL起依法測定吸光度。代入標準曲線，計算總黃酮的濃度。精密量取洗脫液適量，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷至室溫，精密稱重，計算所得純化物中總黃酮的含量分別為51.8%、48.5%、46.4%。

2.5 結果

試驗結果表明，最佳純化條件為樣品與聚酰胺的比例為1∶10，10倍量柱體積的60%乙醇洗脫。

2.6 工藝驗證

取供試品5 g(平行3份)，精密稱定，按照2.3項下的方法制備上柱溶液，加到已處理好的聚酰胺(50 g)柱上(30 cm×5 cm)，分別用10倍量柱體積的60%乙醇洗脫，收集洗脫液，搖勻，精密量取0.3 mL置10 mL容量瓶中，照2.2項下的方法自加入5%的亞硝酸鈉0.4 mL起，依法測定吸光度。代入標準曲線，計算總黃酮的濃度。精密量取洗脫液適量，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃烘3 h，取出，置干燥器中冷至室溫，精密稱重，計算所得純化物中總黃酮的含量分別為51.6%，52.5%，50.9%，表明優(yōu)選的純化工藝穩(wěn)定可行。

3 結論與意義

采用薄層色譜法，獼猴桃藤粗提物色譜中在與蘆丁對照品相應的位置出現相同的斑點，表明獼猴桃藤粗提物中含有蘆丁，故本文選擇蘆丁作為對照品測定獼猴桃藤粗提物純化前后總黃酮的含量。本文采用單因素試驗，篩選影響獼猴桃藤粗提物中總黃酮純化效果的主要因素，并對優(yōu)化的純化工藝進行放大試驗驗證，為獼猴桃藤總黃酮工業(yè)化生產及開發(fā)利用提供參考。

本試驗以蘆丁為對照品，用紫外-分光光度法對總黃酮進行含量測定，通過聚酰胺柱層析對獼猴桃藤中總黃酮純化效果進行篩選。結果表明，樣品與聚酰胺的比例為1∶10，洗脫劑為10倍量柱體積60%的乙醇，所得純化物中總黃酮含量最高，可達51.8%。本試驗對優(yōu)化的工藝進行放大試驗驗證，結果純化效果較為理想，純化后總黃酮的含量可高達50%以上，與單因素考察所得的最佳純化效果進行比較，無顯著差異。該純化工藝簡單、可行，重復性好，可用于獼猴桃藤中總黃酮的純化。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草：第九卷(第三冊) [ M].上海：上海科學技術出版社，1999.

[2] 赫軍，馬秉智，趙鐵.藤梨根的化學成分研究[J].中國藥學雜志.2014，49(3)：184-186.

[3] 邸學，海波，楊欣欣.藤梨根藥材HPLC指紋圖譜及質量研究[J].中國實驗方劑學雜志.2013，19(10)：135-137.

[4] 龍凱花，王小平，白吉慶.中藥藤梨根抗腫瘤研究[J].中國現代中藥，2013，15(10)：846-849.

[5] 邸學，徐洋洋，裴世柱.響應面法優(yōu)化藤梨根總生物堿提取工藝[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報.2013，15(7)：58-61.

[6] 王小平，白吉慶.藤梨根總黃酮提取方法及含量測定研究[J].陜西中醫(yī)學院學報，2008，31(3)：65-66.

Purification Process of total flavonoids in Vine ofActinidiachinensis

LI Xue，LI Donghong，WANG Xiaoping*，BAI Jiqing

(Shaanxi University of TCM, Xianyang 712046，Shaanxi，China)

Objective：To optimize of flavonoids purification process ofActinidiachinensisvine.Methods：The optimized The purification process of the flavonoids was optimized with the total flavonoids as a index.Results：Optimal purification process was as following: The ratio of samples and adsorbent 1∶10, tenfold column volumes of 60% ethanol elute, the content of total flavonoids was 71.8%.Conclusion：The purification process is simple and feasible, and can be used for purification of total flavonoids in vine ofA.chinensis.

Vine ofActinidiachinens；total flavonoids；purification process；orthogonal design

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.010

2015-01-28)

陜西省科技資源統(tǒng)籌中藥現代化專項(2012KTCL03-14)；陜西省大學生創(chuàng)新訓練項目(1689)

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王小平，副教授，碩士生導師，研究方向：中藥質量分析與新藥研究；E-mail：wangxiaoping323@126.com