郭安臣，趙一龍，蘇芳，李巍巍，王擁軍，王群

卒中已成為我國主要的死亡原因之一，而缺血性卒中占卒中的60%～80%，具有高致殘、高致死的特點[1]。除急性期溶栓外，神經(jīng)保護劑對缺血性卒中患者的康復有重要的意義[2]。腦苷肌肽為復方制劑，是由健康家兔肌肉提取物和牛腦神經(jīng)節(jié)苷脂提取物混合制成的無菌水溶液。主要組分為多肽、多種神經(jīng)節(jié)苷脂、游離氨基酸、核酸等，是目前臨床常用的神經(jīng)保護藥物。但有關(guān)腦苷肌肽保護作用的機制尚有待探討。因此，進一步研究腦苷肌肽在缺血性卒中后的神經(jīng)保護機制，對于了解缺血性卒中的神經(jīng)保護及研發(fā)新的神經(jīng)保護劑有重要的意義。

星形膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)主要的細胞類型，數(shù)量超過神經(jīng)元的5倍以上，對維持神經(jīng)元的生理功能起到重要作用[3]。而星形膠質(zhì)細胞可以減輕腦水腫、減少自由基損傷等作用對缺血性卒中有越來越多的意義[4]。近年來，有關(guān)星形膠質(zhì)細胞的神經(jīng)保護作用日益受到研究者的重視。本實驗從研究腦苷肌肽對星形膠質(zhì)細胞的影響入手，進一步探討腦苷肌肽對神經(jīng)元的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗用鼠為SPF級Sprague Dawley（SD）大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。其中，孕16～18 d的SD大鼠（10只）用于神經(jīng)元培養(yǎng)，生后24 h的SD乳鼠（10只）用于星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 杜爾伯科極限必需培養(yǎng)基（Dulbecco minimum essential medium，DMEM）、Neurobasal培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購Invitrogen公司。細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶及離心管購自Corning公司。鼠抗神經(jīng)絲蛋白（neurofilament，NF）單克隆抗體、鼠抗膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cellderived neurotrophic factor，GDNF）單克隆抗體、兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽［2，2’-Azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH］、碘化丙啶（propidium iodide）等購自Sigma公司。Alexa Fluor 568標記的山羊抗兔抗體、 Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠抗體購自Molecular Probes公司。Western Blot相關(guān)試劑購自普利萊公司。CCK-8細胞活性試劑盒購自東仁公司。腦苷肌肽由吉林四環(huán)制藥有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 用10%水合氯醛將16～18 d孕齡大鼠麻醉后，置于超凈工作臺內(nèi)，無菌條件下分離出胚胎，轉(zhuǎn)移到Neurobasal培養(yǎng)基中。取皮層，剔除腦膜、血管，用培養(yǎng)基洗滌2次，剪碎，吹打分散細胞，0.25%胰酶消化10 min，過濾去除所有組織塊，將細胞混懸于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)基中，接種于24孔培養(yǎng)板中，第2天去除培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，更換為神經(jīng)元培養(yǎng)基：含有2%B-27添加劑的Neurobasal培養(yǎng)基，之后隔天換液。7 d后用于實驗。

1.2.2 原代星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng) 將出生24 h內(nèi)的SD乳鼠低溫麻醉后置于75%乙醇中浸泡消毒5 min，無菌條件下去除顱骨，取出腦組織，置于裝有預冷DMEM的無菌玻璃皿中，清洗3次，在解剖鏡下用顯微鑷剝離腦膜及血管，將組織碎塊轉(zhuǎn)入裝有5 ml 0.25%胰蛋白酶液的離心管內(nèi)，放入37℃水浴培養(yǎng)箱中消化30 min，加入完全培養(yǎng)基（10%FBS+DMEM+雙抗）終止消化，用吸管吹打20～30次，形成細胞懸液。經(jīng)70 μm孔徑濾網(wǎng)過濾去除組織碎塊，收取細胞懸液后，1500轉(zhuǎn)/分離心5 min，去除上清液，重懸細胞后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，2～3 d換液1次，培養(yǎng)7～9 d后使用。

1.2.3 免疫熒光染色 原代培養(yǎng)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min后，經(jīng)磷酸緩沖液（phosphate buffer，PBS）沖洗后加入0.2%Triton-X-100增加細胞膜的通透性，用10%山羊血清封閉抗原位點，鼠抗NF單克隆抗體（1∶400）、兔抗GFAP多克隆抗體（1∶500）分別加入到培養(yǎng)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中。4℃孵育過夜。充分清洗后分別加入Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠抗體（1∶400），Alexa Fluor 568標記的山羊抗兔抗體（1∶400）室溫孵育1 h。熒光顯微鏡下觀察，采集圖片。

1.2.4 AAPH模擬缺血性卒中誘導神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞損傷 AAPH溶于DMEM中制備1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L和40 mmol/L的溶液，分別加入神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中，同時加入CCK-8溶液，作用4 h后，利用分光光度計測定495 nm波長的吸光度，從而分析細胞活力，觀察AAPH對細胞活力的影響。對照組未加AAPH，其他培養(yǎng)條件與AAPH損傷組一致。

1.2.5 腦苷肌肽對AAPH誘導星形膠質(zhì)細胞損傷的影響 原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，經(jīng)傳代純化后，先用40 mmol/L AAPH誘導損傷4 h。更換新培養(yǎng)基并加入0.025 μg/ml、0.05 μg/ml和0.1 μg/ml的腦苷肌肽作用24 h，之后加入CCK-8檢測細胞活力。對照組未加AAPH，其他培養(yǎng)條件與AAPH損傷組一致。

1.2.6 腦苷肌肽－星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基制備原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，先用40 mmol/L的AAPH誘導損傷4 h。更換培養(yǎng)基并加入0.1 μg/ml的腦苷肌肽，保護24 h，之后收集培養(yǎng)上清液，經(jīng)0.22 μm孔徑濾網(wǎng)過濾備用。

1.2.7 Western Blot 原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，先用40 mmol/L的AAPH誘導損傷4 h。更換培養(yǎng)基并加入0.025 μg/ml、0.05 μg/ml和0.1 μg/ml的腦苷肌肽，保護24 h。對照組未加AAPH，其他培養(yǎng)條件與AAPH損傷組一致。經(jīng)裂解、破碎、離心后，用Bradford法進行蛋白定量，調(diào)整各樣品蛋白終濃度為20 μg/ml。取20 μl樣品進行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，滴加相應(yīng)的GDNF抗體，滴加相應(yīng)二抗（1∶1000），室溫孵育2 h。PBS清洗，加入增強化學發(fā)光液（enhanced chemiluminescence solution）反應(yīng)1～5 min，觀察蛋白表達情況，并用Image J進行蛋白定量。

1.3 統(tǒng)計與分析 采用SPSS 15.0進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以（s）表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 AAPH能夠模擬卒中制備神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞損傷模型 原代培養(yǎng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞后經(jīng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞特異性的標志物染色鑒定，培養(yǎng)的細胞分別表達神經(jīng)元特異性標志物NF和GFAP，表明培養(yǎng)的細胞分別為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞（圖1A，圖1B）。而給予不同濃度AAPH可對神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞造成損傷，細胞活性隨AAPH濃度的增加而下降（圖1C，圖1D）。其中40 mmol/L AAPH可以明顯誘導神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的損傷。

2.2 腦苷肌肽能夠減輕AAPH誘導的星形膠質(zhì)細胞的損傷 基于40 mmol/L AAPH能夠誘導星形膠質(zhì)細胞損傷，在AAPH損傷4 h后，分別給予0.025 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.2 μg/ml的腦苷肌肽共同孵育24 h，檢測星形膠質(zhì)細胞活力。結(jié)果表明，不同濃度的腦苷肌肽均能夠減輕AAPH造成的星形膠質(zhì)細胞損傷，其中0.05 μg/ml和0.1 μg/ml的腦苷肌肽的保護作最為顯著（圖2）。而0.2 μg/ml的腦苷肌肽未表現(xiàn)出對星形膠質(zhì)細胞的保護作用。

2.3 腦苷肌肽-星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基能夠減輕AAPH對神經(jīng)元的損傷 實驗表明0.1 μg/ml的腦苷肌肽能夠明顯減輕AAPH誘導的星形膠質(zhì)細胞的損傷作用。因此，本課題選用40 mmol/L AAPH誘導星形膠質(zhì)細胞損傷，進而繼續(xù)加入0.1 μg/ml的腦苷肌肽作用24 h后的細胞上清液作為條件培養(yǎng)基。在40 mmol/L AAPH誘導神經(jīng)元損傷后加入腦苷肌肽-星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基作用24 h。檢測神經(jīng)元細胞活力。結(jié)果表明腦苷肌肽-星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基能夠逆轉(zhuǎn)AAPH造成的神經(jīng)元損傷，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義（圖3）。

2.4 腦苷肌肽-星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基能夠減輕AAPH誘導的神經(jīng)元凋亡 PI是一種脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）染料，能夠摻入到受損的DNA中，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞不能著色，而損傷及死亡細胞產(chǎn)生紅色熒光，可以作為一種檢測細胞凋亡的指標。我們的實驗表明，在給予腦苷肌肽-星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基作用24 h后，神經(jīng)元凋亡的數(shù)量和AAPH損傷組相比明顯減少（圖4）。

圖1 AAPH可以模擬缺血性卒中誘導神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞損傷注：原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞體較小，突起分支少而較長，能夠特異性表達神經(jīng)元標志物NF（圖1A）。原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞，突起分支多而較短，免疫熒光染色表明細胞能夠特異性表達GFAP（圖1B）。AAPH可以模擬腦缺血，10 mmol/L AAPH即可造成神經(jīng)元的損傷，而對星形膠質(zhì)細胞20 mmol/L AAPH才表現(xiàn)出損傷作用（“*”表明和對照組差異具有顯著性）。AAPH：2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽；NF：抗神經(jīng)絲蛋白；GFAP：抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白

圖2 腦苷肌肽能夠減輕AAPH誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷注：40 mmol/L AAPH能夠造成明顯的星形膠質(zhì)細胞損傷，0.025 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml的腦苷肌肽能夠減輕細胞損傷，其中0.05 μg/ml、0.1 μg/ml腦苷肌肽的作用和對照組相比差異具有顯著性（“*”表明P＜0.05）。而0.2 μg/ml的腦苷肌肽未表現(xiàn)出對星形膠質(zhì)細胞的保護作用。AAPH：2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽

圖3 腦苷肌肽－星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基能夠減輕AAPH誘導的神經(jīng)元損傷注：和對照組相比，40 mmol/L AAPH能夠誘導神經(jīng)元損傷，給予腦苷肌肽－星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基后，神經(jīng)元損傷減輕，細胞活力明顯恢復（“*”表明AAPH損傷和對照組相比細胞活力明顯降低，差異具有顯著性，P＜0.05?！?*”表明腦苷肌肽－星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基能夠減輕AAPH誘導的神經(jīng)元損傷，差異具有顯著性，P＜0.05）。AAPH：2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽

2.5 腦苷肌肽促進星形膠質(zhì)細胞合成GDNF 原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞經(jīng)傳代種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，AAPH誘導損傷4 h后，分別給予0.025 μg/ml、0.05 μg/ml、0.1 μg/ml的腦苷肌肽共同孵育24 h，收取、裂解細胞蛋白，檢測細胞中GDNF水平。Western Blot結(jié)果顯示腦苷肌肽能促進星形膠質(zhì)細胞合成GDNF，并呈明顯的濃度依賴性。其中0.1 μg/ml腦苷肌肽組的GDNF水平明顯高于AAPH損傷組、0.025 μg/ml腦苷肌肽組和0.05 μg/ml腦苷肌肽組，差異具有顯著性（圖5）。

3 討論

缺血性卒中由于腦部血液供應(yīng)障礙，能量耗竭造成大腦局限性腦組織的缺血性壞死或腦軟化[5]。而缺血性卒中的治療主要集中在溶栓和神經(jīng)保護等方面[6-7]，治療的重點是減輕神經(jīng)元損傷、保護神經(jīng)元功能。盡管以神經(jīng)元為中心的神經(jīng)保護研究取得了一定進展，但由于缺血性卒中病理生理機制極為復雜。同時細胞與細胞之間的相互聯(lián)系、相互作用尚不明確，使得神經(jīng)保護藥物的研究受到極大影響[8]。

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)總數(shù)量最多的細胞類型，傳統(tǒng)觀點認為星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持[9]。但近來研究發(fā)現(xiàn)，在損傷后成熟的星形膠質(zhì)細胞可去分化為放射狀膠質(zhì)細胞使得腦損傷功能紊亂的神經(jīng)系統(tǒng)連接得以恢復[10]。而溴化乙啶可以特異性與膠質(zhì)細胞DNA和RNA結(jié)合，干擾其核酸與蛋白質(zhì)合成，使得腦缺血模型中星形膠質(zhì)細胞增生受抑制，梗死灶增大，可見星形膠質(zhì)細胞可保護腦缺血后的神經(jīng)元損傷[11]。這使得星形膠質(zhì)細胞成為神經(jīng)保護藥物研發(fā)的新熱點[12]。

AAPH是一種氧自由基生成劑，能夠在細胞中生成自由基，進而模擬缺血性卒中后自由基對細胞損傷[13-14]。本實驗結(jié)果表明，AAPH能夠?qū)ι窠?jīng)元造成損傷，但4～6 h等短時間作用于星形膠質(zhì)細胞能夠增加星形膠質(zhì)細胞的活性，表明和神經(jīng)元相比，星形膠質(zhì)細胞在缺血性腦損傷后對自由基損傷有更強的耐受性，而同時給予腦苷肌肽后的培養(yǎng)基上清液能夠減輕AAPH對神經(jīng)元的損傷[15]。

圖4 腦苷肌肽－星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基減輕AAPH誘導的神經(jīng)元凋亡注：碘化丙啶可以標記損傷后凋亡的細胞，實驗給予AAPH后，凋亡細胞明顯增多，而給予腦苷肌肽－星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基后，凋亡細胞明顯減少（“*”表明AAPH損傷和對照組相比凋亡細胞明顯增多，差異具有顯著性，P＜0.05。“**”表明腦苷肌肽－星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基能夠減少細胞凋亡，差異具有顯著性，P＜0.05）。注：AAPH：2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽

圖5 腦苷肌肽促進星形膠質(zhì)細胞合成GDNF注：腦苷肌肽能夠促進星形膠質(zhì)細胞合成GDNF，不同濃度的腦苷肌肽作用于星形膠質(zhì)細胞24 h后，星形膠質(zhì)細胞表達GDNF隨著腦苷肌肽濃度的增加而增多。其中，0.05 μg/ml、0.1 μg/ml的腦苷肌肽作用組和對照相比差異具有顯著性（P＜0.05）。GDNF：膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

腦苷肌肽具有神經(jīng)保護作用。腦苷肌肽系由健康家兔肌肉提取物和牛腦神經(jīng)節(jié)苷脂提取物混合制成的無菌水溶液。其主要組份為多肽、多種神經(jīng)節(jié)苷脂、游離氨基酸、核酸等。既往研究表明，腦苷肌肽具有神經(jīng)保護作用，能夠通過消炎等機制保護神經(jīng)元，臨床應(yīng)用同樣表明，腦苷肌肽能夠減輕缺血性卒中患者癥狀，改善功能，促進恢復[16]。本實驗通過體外細胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)腦苷肌肽-星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基能夠降低AAPH誘導的神經(jīng)元凋亡，增加神經(jīng)元細胞活性。表明腦苷肌肽具有神經(jīng)保護作用。

腦苷肌肽的保護作用是通過促進星形膠質(zhì)細胞合成分泌GDNF間接發(fā)揮作用。GDNF是由膠質(zhì)細胞分泌的一種神經(jīng)生長因子，對神經(jīng)元有明顯的保護作用[17]。動物實驗表明，預先定位側(cè)腦室注射GDNF，可有效對抗腦缺血后神經(jīng)元的凋亡[18]。在永久性腦缺血模型中給予GDNF，同樣可減小梗死灶，減輕腦水腫，抑制神經(jīng)元凋亡[19]。本研究通過離體細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)腦苷肌肽不僅能夠減輕AAPH誘導的星形膠質(zhì)細胞損傷，同時腦苷肌肽作用于AAPH刺激的星形膠質(zhì)細胞，可以增加星形膠質(zhì)細胞合成GDNF，從而發(fā)揮保護神經(jīng)元的作用。

腦苷肌肽具有神經(jīng)保護作用，其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的一種可能機制是促進星形膠質(zhì)細胞合成膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)生長因子。同時實驗表明星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)保護作用的一個靶點，通過保護星形膠質(zhì)細胞能夠達到保護神經(jīng)元進而促進卒中患者康復的作用。

1 Flynn RW, MacWalter RS, Doney AS. The cost of cerebral ischaemia[J]. Neuropharmacology,2008, 55:250-256.

2 Sutherland BA, Minnerup J, Balami JS,et al. Neuroprotection for ischaemic stroke:translation from the bench to the bedside[J]. Int J Stroke, 2012, 7:407-418.

3 Hines DJ, Haydon PG. Inhibition of a SNARE sensitive pathway in astrocytes attenuates damage following stroke[J]. J Neurosci, 2013,33:4234-4240.

4 陳慧, 崔慶宏, 張擁波, 等. 以星形膠質(zhì)細胞為靶點治療缺血性腦卒中的機制探討[J]. 神經(jīng)損傷與功能重建, 2012, 7:50-53.

5 Iadecola C, Anrather J. Stroke research at a crossroad:asking the brain for directions[J].Nature Neurosci, 2011, 14:1363-8.

6 Hacke W, Kaste M, Bluhmki E, et a1. For the ECASS investigators. Thrombolysis with altheplase 3 to 4. 5 hours after acute ischemic stroke[J]. N Engl J Med, 2008,359:1317-1329.

7 Kikuchi K, Uchikado H, Morioka M, et al.Clinical neuroprotective drugs for treatment and prevention of stroke[J]. Int J Mol Sci,2012, 13:7739-7761.

8 Shualb A, Hussin MS. The past and future of neuroprotection in cerebral ischaemic stroke[J]. Euro Neurol, 2008, 59:4-14.

9 Parpura V, Heneka MT, Montana V, et al. Glial cells in (patho) physiology[J]. J Neurochem,2012, 121:4-27.

10 Blair R, Leavit T, Cynthia S, et al. Mature astroctes transform into transitional radia glia within adult mouse neocortex that supports directed migration of transplanted immature neurons[J]. Exp Neurol, 1999, 157:43-57.

11 Louw DF, Masada T, Sutherland GR. Ischemic neuronal injury is ameliorated by astrocyte activation[J]. Can J Neurol Sci, 1998, 25:102-107.

12 Barreto G, White RE, Ouyang YB, et al.Astrocytes:Targets for neuroprotection in stroke[J]. Cent Nerv Syst Agents Med Chem,2011, 11:164-173.

13 Kang MC, Cha SH, Wijesinghe W, et al. Protective effect of marine algae phlorotannins against AAPH-induced oxidative stress in zebrafish embryo[J]. Food Chem,2013, 138:950-955.

14 Zhang Y, Milatovic D, Aschner M, et al.Neuroprotection by tamoxifen in focal cerebral ischemia is not mediated by an agonist action at estrogen receptors but is associated with antioxidant activity[J]. Exp Neurol, 2007, 204:819-827.

15 Kim EA, Lee SH, Ko CI, et al. Protective effect of fucoidan against AAPH-induced oxidative stress in zebrafish model[J].Carbohydr Polym, 2014, 102:185-191.

16 楊永升, 王津津. 腦苷肌肽對rd小鼠視網(wǎng)膜細胞保護作用的研究[J]. 眼科新進展, 2012, 22:1131-1133.

17 Lin LF, Doherty D, Lile, et al. GDNF, a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons[J]. Science, 1993,260:1130-1132.

18 Miyazaki H, Okumay Y, Fujii Y, et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor protects against delayed neuronal death after transient forebrain ischemia in rats[J]. NeuroScience,1999, 89:643-647.

19 Kitagawa H, Hayashi T, Mitsumoto Y, et al. Reduction of ischemic brain injury by topical application of glial cell line-derived neurotrophic factor after permanent middle cerebral artery occlusion in rats[J]. Stroke,1998, 29:1417-1422.

【點睛】

本實驗通過體外研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞是卒中后神經(jīng)保護的重要靶點，對神經(jīng)保護新藥的研發(fā)有重要的理論指導意義。