鄭翾，梁燕玲，陳佳，陳智毅，李斯穎，羅建華，方小波

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）負(fù)責(zé)啟動胞內(nèi)一系列細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，引起促炎癥因子的生成和釋放，促使免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生，以清除病原微生物；其中TLR4是該家族中有代表性的一員，能特征性地識別革蘭陰性菌壁中的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（外源性配體）及識別機(jī)體的各種危險(xiǎn)信號（內(nèi)源性配體）從而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥和免疫反應(yīng)。既往的研究證明TLR4通路參與了腦缺血后的神經(jīng)損傷機(jī)制[1-2]。而本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)TLR4與高血糖合并腦缺血后的癇性發(fā)作相關(guān)[3]，而TLR4拮抗劑可明顯減少急性癲癇模型的癇性發(fā)作頻率、縮短發(fā)作持續(xù)時間，推遲首次發(fā)作的發(fā)生[4]。因此，如果能找出一種安全低價(jià)高效的方法抑制TLR4的表達(dá)，則有可能減輕患者腦缺血后的神經(jīng)損傷，也有可能降低高血糖合并腦缺血后的癇性發(fā)作。

核糖核酸干擾（RNA interference，RNAi）是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈核糖核酸（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象[5]。其高度的特異性及抑制性能有效降解目的基因的信使RNA（messenger deoxyribonucleic acid,mRNA），該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域。在該技術(shù)中，短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）有著良好的抑制效果及持續(xù)時間。傳統(tǒng)的基因載體使用的病毒載體因其免疫原性及對操作者的潛在危害限制了它的臨床應(yīng)用，而超聲靶向微泡破裂（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）具有安全性、靶向性、促藥物滲透或轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)[6]，可攜帶基因或藥物到達(dá)靶組織，成為近年來藥物載體的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)觀察UTMD聯(lián)合shRNA的方法沉默腦中TLR4的可行性，促進(jìn)對非侵襲性的基因傳輸?shù)牧私狻?/p>

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 根據(jù)文獻(xiàn)[5]，選擇TLR4-439起始點(diǎn)為靶序列（靶序列如下：TTAAGAAGCTATAGCTTCACC。設(shè)計(jì)shDNA模板序列為5’-CACCGTTAAGCTATAGCTTCACCTTCAAGAGAGGT GAAGCTATAGCTTCTTAATTTTTTG-3’，3’-CAATTC TTCGATATCGAAGTGGAAGGTTCTCTCCACTTCGATATC GAAGAATTAAAAAACCTAG-5’。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為GTTAAG AAGCTATAGCTTCACCTTCAAGAGAGGTGAAGCTATAGC TTCTTAATT。由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成并插入到pGPU6/Neo中，生成pGPU6/Neo-Tlr4-Rat-439質(zhì)粒。SonoVue微泡為Bracco公司產(chǎn)品；超聲儀經(jīng)顱多普勒超聲（以色列RIMED公司），超聲探頭直徑1.5 cm，超聲頻率2 MHz。Bio-Rad電泳儀（Bio-Rad公司），Mini PROTEAN Tetra System電泳儀（Bio-Rad公司），Multimade Plate Reader酶標(biāo)儀（Enspire-PerkinElmer公司），G-Box凝膠成像系統(tǒng)（G-Box公司）。

1.2 SonoVue/DNA復(fù)合物制備 使用0.9%生理鹽水溶液配制SonoVue微泡懸液，通過倒置或振蕩使微泡均勻分布，微泡密度為2×108～5×108/ml，濃度5 mg/ml。實(shí)驗(yàn)前將100 μl SonoVue與100 μl質(zhì)粒DNA溶液（含5 ng質(zhì)粒）混勻，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法 Wistar大鼠（雄性，250～300 g，6～8周）購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境。實(shí)驗(yàn)動物分4組，每組8只共32只：空白對照組（NS），在正常大鼠側(cè)腦室內(nèi)注入40 μl生理鹽水；裸質(zhì)粒組（P），在正常大鼠側(cè)腦室內(nèi)注入40 μl質(zhì)粒溶液（含20 μl質(zhì)粒）；質(zhì)粒聯(lián)合超聲輻照組（P+S+UTMD），在正常大鼠側(cè)腦室內(nèi)注入40 μl質(zhì)粒溶液后予以超聲輻照；質(zhì)粒與SonoVue聯(lián)合超聲輻照組（P+UTMD），在正常大鼠側(cè)腦室內(nèi)注入SonoVue/DNA后予以超聲輻照。大鼠予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于立體定位儀上行雙側(cè)側(cè)腦室注射，每側(cè)各注射20 μl，注射后留針5 min，拔針后以無漏液視為注射成功，縫皮后超聲探頭涂布耦合凝膠，對大鼠頭部進(jìn)行超聲輻照，超聲探頭直徑1.5 cm，超聲頻率2 MHz，深度38 mm，脈沖超聲，輻照部位為前囟沿著中骨縫向后0.8 mm，照射5 min[7]。術(shù)后4 d內(nèi)Berderson評分為0分者視為手術(shù)成功（Berderson評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：未見行為缺陷；1分：前肢屈曲即提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽性；2分：側(cè)推抵抗力下降即側(cè)向推力實(shí)驗(yàn)陽性，伴前肢屈曲，無轉(zhuǎn)圈行為；3分：同2分行為，伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)）。4 d后殺鼠取腦，觀察大鼠大腦有無出血點(diǎn)并提取注射部位處大腦蛋白行Western Blot觀察TLR4抑制情況，運(yùn)用Quantity One凝膠定量分析軟件（Bio-Rad公司）分析灰度值，將樣品與內(nèi)參灰度值之比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 Western Blot 使用Western Blot配膠試劑盒（碧云天產(chǎn)品），按說明書配制12%的電泳膠并將其放入電泳槽中并加入電泳液至水位線。Marker使用10～170 kDa范圍蛋白Marker（500 μl，Tanon公司產(chǎn)品，CatNo：180-6001）取樣品蛋白并用RIPA裂解液（Radio Immunoprecipitation AssayLysis Buffer）將其濃度調(diào)至20 μg/μl，按每孔10 μl體積加入電泳膠加樣孔中，合上電極并用80 V恒定電壓跑膠至濃縮膠與分離膠分界線時將電壓調(diào)至100 V恒定電壓后繼續(xù)跑膠90 min。電泳完畢后取出電泳膠，將泡過10 s甲醇的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜覆蓋其上，將其放入電轉(zhuǎn)系統(tǒng)中，采用濕性電轉(zhuǎn)法，以250 mA恒定電流轉(zhuǎn)移90 min。電轉(zhuǎn)完畢后取出PVDF膜，以5%脫脂奶粉溶液浸泡并放置在水平搖床上封閉1 h后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗凈，將PVDF膜浸泡于含有1∶2500稀釋的小鼠抗大鼠TLR4多克隆抗體（abcom公司，ab8376）的培養(yǎng)皿中并放置于4℃冰箱中搖動封閉過夜。過夜后將膜取出，以PBS洗膜3次，每次10 min，將膜取出后在盛有1∶5000稀釋的山羊抗大鼠二抗（EarthOx公司，E030110-01）的平皿中在室溫下脫色搖床上搖動孵育1 h后以PBS洗膜3次，每次10 min。PBS洗凈后用ECL發(fā)光液（上海偉進(jìn)生物科技有限公司）于G-Box凝膠成像系統(tǒng)中成像，圖像運(yùn)用Quantity One凝膠定量分析軟件（Bio-Rad公司）分析灰度值，將樣品與內(nèi)參灰度值之比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 免疫組化染色 每組各取3只大鼠用于免疫組化染色，術(shù)后4 d殺鼠取腦，觀察大鼠大腦有無出血點(diǎn)并提取注射部位處大腦，取出后行OCT包埋并作冷凍切片，以13 μm厚度連續(xù)切片，每5張取1張貼片后37℃烘片過夜，烘片后3%H2O2室溫孵育20 min，PBS漂洗3次每次3 min，滴加3%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）封閉30 min后滴加經(jīng)1∶100稀釋的小鼠抗大鼠TLR4多克隆抗體（abcom公司，ab8376）4℃過夜，PBS洗片3次，每次5 min，后滴加山羊抗兔鼠通用二抗（DAKO公司，二抗稀釋比1∶500）室溫孵育50 min。PBS漂洗3次，每次5 min，二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色，顯微鏡下觀察出現(xiàn)棕黃色顆粒時停止顯色，蒸餾水沖洗后蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，對切片編號以實(shí)現(xiàn)盲法觀察，重點(diǎn)觀察取樣部位海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)陽性染色深度。運(yùn)用Image Pro Plus軟件（Media Cybernetic公司）對免疫組織化學(xué)圖片進(jìn)行平均光度值分析。常規(guī)進(jìn)行HE染色和攝片。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用（s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05差異具有顯著性。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中所有大鼠術(shù)后4 d內(nèi)均未出現(xiàn)任何神經(jīng)功能障礙，4組大鼠Berderson評分均為0分，且無任何大鼠死亡。

2.1 TLR4的蛋白表達(dá)情況 4組大鼠TLR抑制后的Western Blot的圖像采用Quantity One凝膠定量分析軟件（Bio-Rad公司）分析灰度值，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒聯(lián)合超聲輻照組和質(zhì)粒與SonoVue聯(lián)合超聲輻照組抑制效果明顯（P+S+UTMD：0.223±0.009，P+UTMD：0.277±0.013，t1，3=4.900，P＜0.01；t1，4=8.779，P＜0.01），裸質(zhì)粒組與空白對照組無明顯差異（NS：0.351±0.030，P：0.339±0.034，t1，2=0.590；P＞0.05），而質(zhì)粒與SonoVue聯(lián)合超聲輻照組與質(zhì)粒聯(lián)合超聲輻照組相比抑制效果更好（P+S+UTMD：0.223±0.009，P+UTMD：0.277±0.013，t3，4=7.006，P＜0.05）（圖1）。

2.2 TLR4抑制后的免疫組化結(jié)果 在海馬CA1區(qū)，TLR4蛋白的陽性染色為棕黃色顆粒，主要表達(dá)在海馬錐形細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)（空白對照組TLR4陽性細(xì)胞數(shù)157.74±2.287；裸質(zhì)粒組TLR4陽性細(xì)胞數(shù)147.50±6.461；質(zhì)粒聯(lián)合超聲輻照組TLR4陽性細(xì)胞數(shù)81.50±5.041；質(zhì)粒與SonoVue聯(lián)合超聲輻照組TLR4陽性細(xì)胞數(shù)67.75±2.016，每組n=3），平均光度值分析顯示，質(zhì)粒聯(lián)合超聲輻照組和質(zhì)粒與SonoVue聯(lián)合超聲輻照組抑制效果明顯（P+S+UTMD：0.026±0.0013，P+UTMD：0.058±0.0014，t1，3=8.334，P＜0.01；t1，4=21.027，P＜0.01），裸質(zhì)粒組與空白對照組無明顯差異（NS：0.079±0.0048，P：0.077±0.0012，t1，2=0.797；P＞0.05），而質(zhì)粒與SonoVue聯(lián)合超聲輻照組和質(zhì)粒聯(lián)合超聲輻照組相比抑制效果更好（P+S+UTMD：0.026±0.0013，P+UTMD：0.058±0.0014，t3，4=33.254，P＜0.05）（圖2）。

3 結(jié)論

TLR4除特征性識別革蘭陰性菌壁中的LPS外，還能識別機(jī)體的各種危險(xiǎn)信號（內(nèi)源性配體），主要的內(nèi)源性配體是高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）。Hyakkoku等[3]將敲除TLR3，TLR4，TLR9相關(guān)基因的3種小鼠短暫大腦中動脈缺血2 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有TLR4基因敲除小鼠的梗死面積縮小且神經(jīng)功能損傷較小，而其他基因敲除小鼠均無上述表現(xiàn)。Moraga等[8]在敲除TLR4的小鼠大腦中動脈缺血后的第7天發(fā)現(xiàn)室管膜下區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量少于野生型小鼠，但第14天時，神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目多于野生型小鼠，可見抑制TLR4能促使神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目增多。如果能抑制TLR4表達(dá)，將有助于改善腦梗死預(yù)后，本課題組曾采用超聲介導(dǎo)載藥微泡的方法成功促進(jìn)急性腦梗死后的神經(jīng)再生和血管新生[9]，因此希望能通過超聲介導(dǎo)微泡造影劑攜帶shRNA質(zhì)?？梢愿玫匾种芓LR4表達(dá)，進(jìn)一步為體內(nèi)采用該法進(jìn)行基因治療打下基礎(chǔ)。

圖1 4組大鼠TRL抑制蛋白表達(dá)情況注：超聲探頭直徑1.5 cm，超聲頻率2 MHz，深度38 mm，脈沖超聲，輻照部位為前囟沿著中骨縫向后0.8 mm，照射5 min。圖中可見質(zhì)粒聯(lián)合微泡超聲輻照組TLR4蛋白表達(dá)明顯比其他3組要少。而空白對照組和裸質(zhì)粒組區(qū)別不大。TLR4：Toll樣受體4，GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氧酶（內(nèi)對照）

圖2 大鼠大腦TLR4蛋白表達(dá)免疫組化圖注：觀察部位為海馬CA1區(qū)。其中A、B、C、D分別為空白對照組、裸質(zhì)粒組、質(zhì)粒聯(lián)合超聲輻照組、質(zhì)粒與SonoVue聯(lián)合超聲輻照組（x200）。A1、B1、C1、D1分別為空白對照組、裸質(zhì)粒組、質(zhì)粒聯(lián)合超聲輻照組、質(zhì)粒與SonoVue聯(lián)合超聲輻照組（x400），E、F、G、H分別為空白對照組、裸質(zhì)粒組、質(zhì)粒聯(lián)合超聲輻照組、質(zhì)粒與SonoVue聯(lián)合超聲福照組的海馬CA1區(qū)的HE染色（x200）。圖中箭頭所指為海馬CA1區(qū)細(xì)胞；HE：蘇木精-伊紅；TLR4：Toll樣受體4

腦缺血可以選擇性地?fù)p傷海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，而其他亞區(qū)的神經(jīng)元則不受損傷[10-11]，因此，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察CA1區(qū)的TLR4的抑制情況，結(jié)果顯示，相較于對照組和裸質(zhì)粒組，質(zhì)粒聯(lián)合超聲輻照組和質(zhì)粒與SonoVue聯(lián)合超聲輻照組的TLR4蛋白表達(dá)明顯減少，因此超聲靶向微泡破裂技術(shù)聯(lián)合shRNA可能可以有效抑制CA1區(qū)錐形細(xì)胞的TLR4表達(dá)。

RNAi是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由dsRNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。使用該技術(shù)可以特異性地結(jié)合細(xì)胞RNA，導(dǎo)致目的基因的mRNA分解，隨后使相應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。當(dāng)前，RNAi技術(shù)的主要兩種類型為化學(xué)合成siRNA和shRNA[12-13]。siRNA載體易于轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，在沉默靶基因中效果顯著，但只能短期抑制基因表達(dá)[14]。然而，shRNA表達(dá)載體可用于體內(nèi)轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生shRNA，并生成相應(yīng)的siRNA，其干擾效果與siRNA相同，而且能夠解決siRNA干擾時間短的缺點(diǎn)，其效果甚至能使靶基因表達(dá)減少并維持?jǐn)?shù)周甚至數(shù)月[15]。在以往的研究中，shRNA對靶基因的抑制效果良好[16]。在將來的應(yīng)用中，需要考慮到應(yīng)盡量減少對患者的操作次數(shù)并保持穩(wěn)定的抑制效率。Liu等[17]使用shRNA抑制Wnt2B2高表達(dá)的A549細(xì)胞、Hela細(xì)胞和PANC1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制效果可以持續(xù)4 d以上。因此，本實(shí)驗(yàn)采用shRNA作為干擾載體，在4 d后提取蛋白發(fā)現(xiàn)對TLR4蛋白仍具有抑制作用，證明shRNA抑制效果可以持續(xù)4 d。

UTMD是指在特定部位使用特定頻率的超聲輻照，使到達(dá)該部位的微泡破裂產(chǎn)生微射流使血管壁或者細(xì)胞膜表面出現(xiàn)可逆性的小孔，增加通透性從而使外源性物質(zhì)如藥物基因載體等更容易進(jìn)入靶器官或者細(xì)胞中從而達(dá)到靶向治療目的[18-19]。UTMD技術(shù)有3大特點(diǎn)：①安全性，超聲微泡造影劑是一種微氣泡混懸液，可經(jīng)過人體代謝時間短，可隨著人體呼吸自然排出，毒副作用小；②靶向傳輸?shù)奶匦裕诎邢虿课唤o予一定功率的超聲輻照（包括較高機(jī)械指數(shù)的診斷超聲），載藥微泡可在特定位置破裂，釋放所攜帶的藥物或基因；③促滲透或轉(zhuǎn)移的作用，微泡破裂可產(chǎn)生空化效應(yīng)、微射流等使微血管或細(xì)胞出現(xiàn)可逆性的小孔使通透性一過性升高，以促進(jìn)藥物或基因的滲透[20]。在實(shí)驗(yàn)中，直接注射質(zhì)粒而不進(jìn)行超聲輻照時，抑制效果和對照組差異無顯著性，而在超聲輻照的輔助下，質(zhì)粒聯(lián)合超聲輻照組和質(zhì)粒與SonoVue聯(lián)合超聲輻照組與對照組相比，TLR4的表達(dá)均有明顯下降。Feichtinger[21]使用可表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的質(zhì)粒并應(yīng)用超聲輻照成功使質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至大鼠股骨缺損處，并使其穩(wěn)定表達(dá)，而且觀察到照射部位骨組織生長，但未經(jīng)過超聲照射部位則無這些表現(xiàn)，可見超聲在基因轉(zhuǎn)移中的重要性。我們對大鼠進(jìn)行了超聲輻照，大鼠術(shù)后4 d內(nèi)神經(jīng)功能評分正常，取腦時未見有出血點(diǎn)。Qiu等[22]在研究中使用2 MHz的低壓超聲聯(lián)合質(zhì)粒-微泡復(fù)合物在體外轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞生長被抑制并觀察到微泡在乳腺癌細(xì)胞上形成的小孔。Guo等[23]使用超聲照射質(zhì)粒-微泡復(fù)合物成功使報(bào)告基因在ECV304細(xì)胞中表達(dá)，說明了通過使用UTMD技術(shù)可使基因成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中并使其表達(dá)。陳智毅[24]通過超聲輻照培養(yǎng)皿中的質(zhì)粒-微泡復(fù)合物，結(jié)果表明超聲輻照不會影響基因的完整性，照射后質(zhì)粒結(jié)構(gòu)完整，沒有發(fā)生斷裂。而本課題組也在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒與SonoVue聯(lián)合超聲輻照組相對于質(zhì)粒聯(lián)合超聲輻照組對TLR4有更明顯的抑制作用，可見超聲靶向微泡擊破提高了基因轉(zhuǎn)染率，可能的機(jī)制是通過超聲的聲孔作用以及微泡的空化效應(yīng)，使胞膜上形成的瞬時孔從而穿透腦脊液-腦屏障[25]。另外，附著在細(xì)胞膜上的脂質(zhì)體微泡與細(xì)胞膜親和力較強(qiáng)，可能和細(xì)胞膜相互作用，使細(xì)胞信號級聯(lián)放大[26]。因此，本實(shí)驗(yàn)中抑制效果得到顯著提高。但相較于其他實(shí)驗(yàn)[23，27-28]，本研究采用的側(cè)腦室注射法，屬于侵襲性操作，傷害較大，有可能導(dǎo)致腦部TLR4蛋白表達(dá)上調(diào)[29］。另外，本研究尚未在腦缺血模型中展開，對注射途徑、質(zhì)粒濃度、微泡濃度也未展開對比分析，觀察時間相對較短，超聲靶向微泡破裂聯(lián)合shRNA的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，超聲微泡造影劑聯(lián)合shRNA質(zhì)粒可高效沉默TLR4基因，該技術(shù)有望應(yīng)用于腦部基因治療，并將為以后非侵襲性的腦部基因傳輸?shù)於ɑA(chǔ)。

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【點(diǎn)睛】

TLR4與腦梗死后癇性發(fā)作及預(yù)后相關(guān)，本研究應(yīng)用超聲靶向微泡破裂聯(lián)合短發(fā)夾核糖核酸干擾技術(shù)沉默TLR4，有望應(yīng)用于腦部基因治療，并將為以后非侵襲性的腦部基因傳輸?shù)於ɑA(chǔ)。