趙換軍, 趙洪良, 譚志軍, 陳 艷, 許永安, 張 茂, 張翠萍△, 付小兵△

(1． 天津醫(yī)科大學， 天津 300070； 2. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，全軍創(chuàng)傷修復與組織再生重點實驗室， 北京 100048；3. 浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院急診科， 杭州 310009)

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人外分泌汗腺細胞分離方法的優(yōu)化*

趙換軍1，2, 趙洪良2, 譚志軍1, 陳 艷2, 許永安3, 張 茂3, 張翠萍2△, 付小兵2△

(1． 天津醫(yī)科大學， 天津 300070； 2. 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，全軍創(chuàng)傷修復與組織再生重點實驗室， 北京 100048；3. 浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院急診科， 杭州 310009)

目的：優(yōu)化人外分泌汗腺細胞的分離方法，以高效地提取外分泌汗腺細胞。方法：新鮮的皮膚樣本剪成組織微粒(大小約1 mm3)，A組采用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)和膠原酶Ⅱ型(2 mg/ml)體積分數(shù)1∶1混合的方法；B組采用傳統(tǒng)消化方法，即膠原酶Ⅱ型；C組采用胰蛋白酶-EDTA消化的方法，三組同時置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),比較三種方法處理后汗腺細胞團的獲取情況。將挑取的汗腺細胞團種于培養(yǎng)皿內(nèi),觀察細胞貼壁和生長情況,并用流式細胞儀測定各組細胞的增殖指數(shù),最后進行免疫細胞化學檢測汗腺細胞標志性蛋白的表達。結(jié)果：A組和C組在消化30 min后，鏡下可見少部分的汗腺細胞團,2 h后A組游離汗腺細胞團明顯增多，C組游離汗腺細胞團很少；B組在消化6 h后，才出現(xiàn)部分游離的汗腺細胞團。將汗腺細胞團培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)C組汗腺細胞貼壁情況差、成活細胞少；A組和B組的汗腺細胞貼壁情況良好，培養(yǎng)9 d后呈“鋪路石樣”生長，細胞增殖指數(shù)分別為(18±4)%和(17±6)%，無明顯差異，免疫細胞化學結(jié)果表明：兩組細胞癌胚抗原(CEA)和細胞角蛋白7(CK7)表達均為陽性。結(jié)論：胰蛋白酶-EDTA和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法能明顯縮短汗腺細胞的分離時間，且不影響細胞的活性和增殖特性。

汗腺; 胰蛋白酶; 膠原酶

皮膚是人體最大的器官，在抵御外界損傷，維持體溫穩(wěn)定，平衡物質(zhì)代謝等方面起著重要的作用[1,2]。作為皮膚附屬器的汗腺，在大面積深度燒傷患者中常常受到嚴重損傷，損傷部位分泌排汗、調(diào)節(jié)體溫的功能喪失，這給患者帶來極大的痛苦。目前，汗腺修復再生方面的研究，主要是誘導多能干細胞向汗腺樣細胞的轉(zhuǎn)分化，來修復再生汗腺[3]。在此研究過程中獲取大量優(yōu)質(zhì)的汗腺是十分必要的,但目前分離獲取外分泌汗腺存在著效率低下、消耗時間長的缺點。本實驗旨在優(yōu)化人外分泌汗腺細胞的分離方法，以高效的獲取外汗腺細胞。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

全層正常皮膚來自解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院普外科手術(shù)病人，術(shù)前經(jīng)患者知情同意。Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)和胎牛血清(Gibco公司)，膠原酶Ⅱ型(Sigma公司)，胰酶-EDTA(Solarbio公司)，小鼠抗人CK7(ab82253)和兔抗人CEA(ab33562)單克隆抗體購自美國Abcam公司，山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。DMEM完全培養(yǎng)基和D-Hank’s溶液均由本實驗室自行配制[4]。

1.2 外分泌汗腺分離培養(yǎng)

將手術(shù)切下約1.5 cm×2.0 cm大小的新鮮全層皮膚，置于含雙抗的D-Hank’s平衡鹽溶液中反復漂洗，除去皮下脂肪后，于60 mm培養(yǎng)皿中,剪為1 mm3大小的組織微粒[5, 6]。將所得的碎皮粒平均為三份后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，A組加入5 ml胰蛋白酶-EDTA(胰蛋白酶0.25%，EDTA 0.53 mmol/L)與膠原酶Ⅱ1∶1的混合液，B組和C組分別加入5 ml的膠原酶Ⅱ型和胰蛋白酶-EDTA消化液，三組同時置于37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中消化，每隔30 min鏡下觀察汗腺細胞團的游離情況。用10 μl的微量移液器在倒置相差顯微鏡下吸取游離的汗腺細胞團,放入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每皿放入大約13～20個汗腺細胞團，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并分別于3 d、6 d、9 d觀察細胞的生長情況。

1.3 流式細胞儀測定細胞的增殖指數(shù)

培養(yǎng)9 d后收集約2×106個細胞，用75%的冷乙醇固定，離心棄上清，將細胞懸浮后，加入10 g/L RNAase 10 μl，37℃水浴孵育30 min后,立即放入冰浴中。加入5 mg/100 ml溴化乙錠染色(4℃,避光孵育30 min),用流式細胞儀(FACS Calibur)檢測并分析結(jié)果。

1.4 免疫細胞化學檢測CEA和CK7的表達情況

棄培養(yǎng)基，加入丙酮和甲醇混合液固定細胞25 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，用3%過氧化氫(H2O2)滅活固定細胞中的內(nèi)源性過氧化物酶10 min。PBS浸洗3次,每次2 min。然后分別加入稀釋后的一抗CEA和CK7，4℃冰箱中過夜。次日復溫40 min后,PBS浸洗后加入二抗(辣根酶標記山羊抗小鼠/抗兔IgG)，室溫孵育30 min，PBS浸洗3次，每次2 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)現(xiàn)用現(xiàn)配(每5 ml加入250 μl DAB溶液)染色，蘇木素復染，鏡下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 不同消化方法分離汗腺的結(jié)果

A組在消化30 min后可見組織結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)了少部分的汗腺團，2 h后，可見大量汗腺細胞團，呈盤曲狀聚集(圖1A)；B組在2 h仍見有大量纖維狀膠原，未見游離汗腺細胞團(圖1B)，6 h后觀察出現(xiàn)較多游離的汗腺細胞團；C組在30 min后可見極少數(shù)汗腺細胞團，汗腺團輪廓不清晰，伴隨著大量的膠原纖維，在2 h后，汗腺細胞團很少(圖1C，見彩圖頁Ⅳ)，繼續(xù)消化出現(xiàn)了一些腺體解離現(xiàn)象[4,7]。

2.2 汗腺細胞的生長狀態(tài)和生長活性觀察

A組獲取的細胞培養(yǎng)3 d后，貼壁生長,周圍有少量細胞開始由腺體向外周蔓延擴散(圖2A)；6 d后以腺體為中心，逐漸形成環(huán)狀單層細胞，多呈扁平不規(guī)則的多邊形(圖2B)；9 d后汗腺細胞在單層細胞的基礎(chǔ)上逐漸形成“鋪路石”樣細胞群(圖2C)；B組獲取的汗腺細胞生長過程和狀態(tài)與A組相似(圖2D、E、F，見彩圖頁Ⅳ)；C組獲取的汗腺腺體貼壁情況差，未見有明顯的細胞生長。故后期實驗不再采用C組細胞。

2.3 汗腺細胞的增殖指數(shù)測定結(jié)果

為了比較組A與組B獲取的汗腺細胞在增殖能力方面的差異，我們測定了兩組汗腺細胞的增殖指數(shù)。結(jié)果顯示：A組獲取的汗腺細胞增殖指數(shù)為(18±4)%,B組獲取的汗腺細胞增殖指數(shù)為(17±6)%,兩組之間無明顯差異。

2.4 汗腺細胞表型的鑒定結(jié)果

對A、B兩組獲取的細胞進行表型鑒定，免疫細胞化學染色結(jié)果表明：在兩組細胞中，汗腺細胞特異性標志蛋白CEA和CK7均表達陽性(圖3，見彩圖頁Ⅳ)，說明A、B兩組所獲取的細胞均為汗腺細胞[8]。

3 討論

胰蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶，通過松解細胞間連接而達到分離效應，消化作用很強，適應于絕大多數(shù)組織的消化與分離[9]。單用胰酶消化(C組)，雖然消化迅速有效，但在后續(xù)的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，貼壁效果很差，存活細胞很少，效果很差。Ⅱ型膠原酶通過水解膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，使上皮細胞與膠原纖維得到分離，適用于纖維性組織的消化，但作用溫和。傳統(tǒng)的分離方法(B組)所消耗時間長,汗腺細胞團長時間暴露于消化酶中,細胞活力會受影響。采用酶聯(lián)合消化的方法(A組)，在其他條件不變的情況下，加快了獲取汗腺細胞的時間，而且簡單易行，不需要額外的設(shè)備。酶聯(lián)合消化法的優(yōu)點是獲取外分泌汗腺細胞速度快，提取的細胞數(shù)量多。獲取的汗腺細胞在隨后的體外培養(yǎng)擴增中，通過鏡下觀察生長狀態(tài)以及流式細胞儀的檢測，發(fā)現(xiàn)細胞存活率及其生長增殖良好，驗證了優(yōu)化方法的效率[10]。本研究雖然提高了外分泌汗腺的獲取效率，但是在汗腺相關(guān)的組織工程應用仍存在著幾方面的問題：1細胞培養(yǎng)的過程中外分泌汗腺細胞生長增殖緩慢；2本文只探討了酶聯(lián)合消化法對于分離細胞的影響，其他方面的影響因素沒有納入系統(tǒng)的考慮中。

通過對傳統(tǒng)消化方法的改良與優(yōu)化，縮短了提取汗腺細胞的時間，為后續(xù)利用干細胞修復與再生汗腺的實驗提供了方便，也為燒傷后汗腺功能恢復的臨床治療及汗腺相關(guān)組織工程研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of primary human eccrine sweet glands’ isolation in vitro

ZHAO Huan-jun1,2, ZHAO Hong-liang2, TAN Zhi-jun1, CHEN Yan2, XU Yong-an3, ZHANG Mao3, ZHANG Cui-ping2△, FU Xiao-bing2△

(1. Tianjin Medical University, Tianjin 300070; 2. Key Laboratory of Tissure Repair and Regeneration, the First Affiliated Hospital of General Hospital of PLA， Beijing 100048; 3. the Second Affiliated Hospital, Medicine School of Zhejiang University， Hangzhou 310009, China)

Objective: To optimize the methods of isolating human eccrine sweat gland cells in vitro so as to get efficiently primary human sweat glands. Methods: The fresh and normal skin tissue was cut into pieces of microskin about 1mm3and the following 3 group digestion buffer was applied to isolated gland cells. The digestion buffer of group A was the equivoluminal mixture of Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) and collagenase-Ⅱ(2 mg/ml). The digestion buffer of group B was collagenase-Ⅱ(2 mg/ml) traditionally and group C was Trypsin-EDTA. These three groups were placed into an incubator simultaneously and the emerging time of dissociated sweat glands was calculated. Sweat glands were sorted out and then placed in culture dish. The adherence and the growth of cells were observed. The proliferation index was detected by flow cytometry. The identification of cultured cells was performed by immunocytochemical staining. Results: After digesting 30 min in group A and C, a very few of dissociated sweat glands were emerging. But after digesting for 2 h , there were lots of dissociated sweat glands emerging in group A rather than in group C. The emergence of dissociated sweat glands in group B would require at least 6 hours. After seeded in culture dishes, the sweat glands in group C couldn’t adhere to the wall of dish, but the sweat glands in group A and B adhered very well and even grew like paving stones after 9 days. In addition, the proliferation index were (18±4)% and (17±6)% respectively, there was no statistical difference. The results of immunocytochemical staining showed that the cells expressed carcino-embryonic antigen(CEA) and cytokeratin 7(CK7) in group A and B. Conclusion: Trypsin-EDTA combined with collagenase-Ⅱ can shorten the time of isolating sweat gland cells and have no effect on cell activity and proliferation.

sweat gland; trypsin; collagenase

國家973計劃資助項目(2012CB518105)；國家自然科學基金項目(81121004,81230041,81171798)

2014-10-22

2015-02-10

R331

A

1000-6834(2015)03-235-03

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.011

△【通訊作者】Tel： 010-66867391; E-mail: zcp666666@sohu.com,fuxiaobing@vip.sina.com