胡秀彩，呂愛(ài)軍

（江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116）

〈綜述〉

蛹蟲(chóng)草菌種退化的探討*

胡秀彩，呂愛(ài)軍**

（江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116）

蛹蟲(chóng)草具有與冬蟲(chóng)夏草極相似的藥理藥效，可以作為冬蟲(chóng)夏草的代用品，但其菌株在繼代培養(yǎng)過(guò)程中極易退化導(dǎo)致產(chǎn)量急劇下降，是影響行業(yè)發(fā)展的核心技術(shù)問(wèn)題。對(duì)蛹蟲(chóng)草退化菌種形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)及子實(shí)體變化，并對(duì)當(dāng)前研究中存在問(wèn)題及解決菌種退化的方法進(jìn)行探討。

蛹蟲(chóng)草；退化菌種；正常菌種

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris），與冬蟲(chóng)夏草（C. sinensis）具有極相似的藥理作用，可作為冬蟲(chóng)夏草的代用品。蛹蟲(chóng)草菌粉在我國(guó)作為一類功能性食品，其有效成分主要是蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草菌素、蟲(chóng)草酸、甾體等，其中蟲(chóng)草菌素是蛹蟲(chóng)草產(chǎn)生的一種重要次生代謝產(chǎn)物，具有細(xì)胞及體液免疫作用。蟲(chóng)草多糖由于其顯著的免疫活性和抗腫瘤作用，已被國(guó)家食品藥品監(jiān)督局受理進(jìn)入臨床審評(píng)階段[1]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蟲(chóng)草屬真菌的開(kāi)發(fā)利用研究比較多，我國(guó)人工栽培蛹蟲(chóng)草技術(shù)已經(jīng)成熟，并進(jìn)入了產(chǎn)業(yè)化發(fā)展階段，但在批量生產(chǎn)中的核心技術(shù)難題是菌種的嚴(yán)重退化和菌株退化的早期檢測(cè)[2]。這是由于菌種在繼代培養(yǎng)過(guò)程中退化比較頻繁，不僅會(huì)導(dǎo)致蛹蟲(chóng)草產(chǎn)量的急劇下降，而且成為影響行業(yè)發(fā)展的核心技術(shù)問(wèn)題，阻礙了蛹蟲(chóng)草栽培業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。在菌類栽培過(guò)程中退化的蛹蟲(chóng)草菌種是可遺傳的，其生理、生化和遺傳過(guò)程極其復(fù)雜，成為蛹蟲(chóng)草批量生產(chǎn)過(guò)程中的核心技術(shù)難題，是生產(chǎn)技術(shù)人員迫切需要得到解決的問(wèn)題[2-4]。解決蛹蟲(chóng)草菌種退化問(wèn)題已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的焦點(diǎn)，而關(guān)于菌種退化遺傳機(jī)理的研究尚未見(jiàn)報(bào)道[5]。

1 形態(tài)學(xué)變化

菌種篩選在人工栽培蛹蟲(chóng)草過(guò)程中，是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的工作，但經(jīng)過(guò)篩選之后的菌種一般在使用半年到一年左右就會(huì)發(fā)生退化現(xiàn)象，退化的菌種不長(zhǎng)子實(shí)體或只產(chǎn)生極少量子實(shí)體。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌種退化后，蛹蟲(chóng)草菌種退化的形態(tài)表現(xiàn)為菌落有角變現(xiàn)象，這是蛹蟲(chóng)草無(wú)性型多型現(xiàn)象的表現(xiàn)之一。退化菌種的子實(shí)體可孕部分有豐富的子囊殼，正常菌種多數(shù)子實(shí)體的可孕部分僅有少數(shù)或沒(méi)有子囊殼[6]。研究表明子囊孢子后代群體不但群體之間在培養(yǎng)性狀上有不同程度的差異，即使是來(lái)自同一子實(shí)體的不同子囊孢子菌株間在菌落顏色、質(zhì)地、生長(zhǎng)速率等性狀上也存在一定差異，各自產(chǎn)生子實(shí)體能力表型也不盡相同。李光榮等[5]研究蛹蟲(chóng)草菌落形態(tài)的多樣性與產(chǎn)子實(shí)體能力表型的觀察，結(jié)果顯示，原代菌株產(chǎn)子實(shí)體能力要比子代菌株未發(fā)生退化部分分離株和已退化部分分離株都強(qiáng)，原代菌落背面顏色為橙鉻色的菌株易長(zhǎng)出發(fā)育良好的子實(shí)體，所產(chǎn)子實(shí)體在形態(tài)上更接近野生蛹蟲(chóng)草，而角變株的子實(shí)體發(fā)生畸形。唐曉慶等[16]研究球孢白僵菌在繼代培養(yǎng)中的菌落角變現(xiàn)象，認(rèn)為菌種退化與菌落角變有著直接關(guān)系。李美娜等[7]研究表明退化菌株在菌絲體階段就能從外部形態(tài)特征在顯微鏡下區(qū)分，退化菌株在培養(yǎng)時(shí)菌絲體見(jiàn)光之后不變色，鏡檢菌絲形態(tài)為菌絲纖細(xì)、彎曲，孢子粘連在一起呈頭狀；正常菌株在見(jiàn)光之后應(yīng)逐漸變?yōu)殚冱S色，鏡檢時(shí)菌絲粗壯、挺立，分生孢子呈念珠狀。李琳等[8]用人工培養(yǎng)基研究發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌會(huì)發(fā)生高頻率的退化現(xiàn)象。這些結(jié)果進(jìn)一步證明，真菌角變顯示出老化相關(guān)的典型特征，為真菌菌落退化研究指明了新的研究方向。

2 子實(shí)體變化

退化菌株與正常菌株相比，培養(yǎng)周期變長(zhǎng)，子實(shí)體原基減少，產(chǎn)孢能力大幅度上升或下降，甚至子實(shí)體生長(zhǎng)受阻[9]。Magae等[10]研究發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌Flammulina velutipes的退化菌株在菌絲體中出現(xiàn)了雙鏈RNA和病毒樣粒子。Hemachandra等[11]發(fā)現(xiàn)NCIMB8052菌株的1種突變株C10，在基因中人為插入1種ISCb1序列能夠延緩菌株退化。Chen等[12]通過(guò)對(duì)Clostridium beijerincki菌株核糖體DNA的分析發(fā)現(xiàn)，其退化菌株中沒(méi)有輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因。李美娜等[7]研究分析了野生菌株與退化菌株的酯酶、蘋(píng)果酸酶和細(xì)胞色素酶等8種同工酶的差異性，發(fā)現(xiàn)退化菌株的部分同工酶不表達(dá)或表達(dá)量很低；林清泉等[13]研究了蛹蟲(chóng)草退化菌株與正常菌株在色度、交配型、脫氫酶的活性和dsRNA感染等的特征差異性，結(jié)果表明，退化菌株在色度培養(yǎng)基中的脫色能力和脫氫酶活性都明顯弱于正常菌株。

研究表明，蛹蟲(chóng)草只有同時(shí)具有2種交配型的單孢菌株才能形成子實(shí)體，而只有1種交配型的單孢菌株未能形成子實(shí)體，但交配型不同的2個(gè)單孢菌株可以通過(guò)配對(duì)雜交形成子實(shí)體。梁月等[24]分離了6個(gè)單子囊孢子群體，只有少部分的單子囊孢子株形成子實(shí)體，而大部分的單子囊孢子菌株未能形成良好的子實(shí)體。對(duì)于此現(xiàn)象，可能存在三種原因：一是交配型偏分離，食用菌中已有很多關(guān)于交配型偏分離現(xiàn)象的報(bào)道，在蛹蟲(chóng)草的培養(yǎng)過(guò)程中同樣存在；二是同宗配合與異宗配合并存，測(cè)定蛹蟲(chóng)草的交配型后，提出蛹蟲(chóng)草是以兩極性異宗配合為主的真菌，本質(zhì)上是異宗配合真菌，但少數(shù)菌株進(jìn)行自交配合形成子實(shí)體；三是交配型的轉(zhuǎn)換，這可能與菌種某些基因的改變有關(guān)。

一些蟲(chóng)生真菌，如綠僵菌和白僵菌等也表現(xiàn)出類似退化現(xiàn)象。退化綠僵菌常表現(xiàn)為產(chǎn)孢量減少或者不產(chǎn)孢子、絨毛狀菌絲的出現(xiàn)，甚至有些菌株在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中形成不育扇形突變區(qū)，高氧化應(yīng)激和線粒體DNA發(fā)生了一些改變[14-15]；而退化的白僵菌則表現(xiàn)出不同形式的菌落局部變化，比如菌絲生長(zhǎng)率突變、菌株毒力下降和產(chǎn)孢量減少等現(xiàn)象。唐曉慶等[16]研究了球孢白僵菌在繼代培養(yǎng)中的菌落角變現(xiàn)象，認(rèn)為菌種退化與菌落角變有著直接關(guān)系。

3 遺傳學(xué)變化

在實(shí)際生產(chǎn)中，優(yōu)良蛹蟲(chóng)草菌株，隨著菌種傳代、轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加或保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，即使栽培條件沒(méi)有變化，菌種也會(huì)表現(xiàn)出不分化子實(shí)體原基和畸形子實(shí)體增加等退化現(xiàn)象，表現(xiàn)在子實(shí)體產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，畸形率上升，甚至不形成子座。蛹蟲(chóng)草菌種的遺傳背景因素是子實(shí)體能否正常發(fā)育的決定因素，其變化應(yīng)該是導(dǎo)致菌種退化的根本原因。影響蛹蟲(chóng)草形成子實(shí)體的主要因素可以分為兩個(gè)方面，一方面是培養(yǎng)條件與環(huán)境因素，另一方面是菌株的遺傳背景因素，與正常菌種相比，退化菌種在遺傳因素上發(fā)生了變異。蛹蟲(chóng)草是復(fù)型真菌，在它的生活史中以無(wú)性孢子（分生孢子）的形成為基本特征的無(wú)性生長(zhǎng)繁殖階段，稱為無(wú)性型；以子座的形成并產(chǎn)生子囊殼和有性孢子（子囊孢子）為基本特征的有性繁殖階段，稱為有性型。在蛹蟲(chóng)草的繁殖過(guò)程中，菌種產(chǎn)生異核現(xiàn)象及其所導(dǎo)致的準(zhǔn)性生殖是某些真菌遺傳變異的重要原因之一。研究表明正常優(yōu)良的蛹蟲(chóng)草菌種是以異核體形式存在的，而退化的蛹蟲(chóng)草菌種是以同核體形式存在的，所以蛹蟲(chóng)草菌種退化的遺傳背景原因是核相發(fā)生了改變，即異核體變成了同核體。同核體僅含有其中的一類交配型基因，不能單獨(dú)完成有性生活史，只有當(dāng)可親和的初生同核菌絲體之間發(fā)生質(zhì)配后，形成含有兩類交配型基因的異核體，才能完成有性生活史，具備形成子實(shí)體的能力[7-8]。

梁宗琦等[17-18]報(bào)道了蛹蟲(chóng)草無(wú)性型的多型現(xiàn)象方面研究，提出蛹蟲(chóng)草擬青霉無(wú)性型不僅是一種異核體，而且有可能是一種異粒體，這一獨(dú)到的見(jiàn)解對(duì)于蛹蟲(chóng)草退化機(jī)理的解釋是一大創(chuàng)舉；在人工培養(yǎng)條件下，蛹蟲(chóng)草等蟲(chóng)草無(wú)性型為適應(yīng)生存條件的改變，一方面通過(guò)某些營(yíng)寄生性基因的丟失或鈍化調(diào)整，另一方面通過(guò)孢子自身菌絲間的原生質(zhì)、細(xì)胞顆粒和核的交換和/或重組而得到調(diào)整。真菌的多型性正是這類丟失、鈍化、交換或重組過(guò)程的形態(tài)表現(xiàn)。李美娜等[7]利用PCR-RFLP和RAPD方法對(duì)野生馴化蛹蟲(chóng)草及其退化菌株進(jìn)行基因水平的分析，發(fā)現(xiàn)野生馴化菌株與退化菌株在DNA水平上已產(chǎn)生明顯的遺傳變異，這種變異無(wú)論是在早期遺傳檢測(cè)，還是在突變機(jī)理研究中都有著十分重要的意義，這一研究對(duì)進(jìn)一步深入開(kāi)展真菌的遺傳變異機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)，為梁宗琦等提出的理論在遺傳物質(zhì)分子分析中找到很好的證據(jù)。高新華等[19]研究了蛹蟲(chóng)草單孢子菌株配對(duì)后對(duì)子實(shí)體形成的影響，以及其與無(wú)性型產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)關(guān)系。薛建娥等[20]對(duì)蛹蟲(chóng)草人工培養(yǎng)種的分離與復(fù)壯進(jìn)行了研究。陳永久等[21-22]用RAPD標(biāo)記對(duì)青藏高原部分地區(qū)冬蟲(chóng)夏草進(jìn)行分析，表明來(lái)自同一地方的樣本遺傳差異很小，地理群間遺傳差異較大，且差異度與地理距離呈正相關(guān)。隨后張?jiān)莆涞萚23]用同樣的方法對(duì)滇西北地區(qū)冬蟲(chóng)夏草、闊孢蟲(chóng)草和蛹蟲(chóng)草進(jìn)行分析，表明同一地區(qū)的同種蟲(chóng)草差異較小，而地理群間和不同種的蟲(chóng)草間差異較大。

至今，針對(duì)蛹蟲(chóng)草菌種退化問(wèn)題，主要嘗試過(guò)以下三種解決方法：一是優(yōu)化培養(yǎng)基，改進(jìn)栽培條件；二是盡量減少轉(zhuǎn)代次數(shù)；三是菌種復(fù)壯。蛹蟲(chóng)草退化菌種的形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)及子實(shí)體變化等相關(guān)研究，仍然十分粗淺，目前國(guó)內(nèi)外尚未能從根本上解決菌種的退化問(wèn)題。

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Discussion of the Degenerate Strains of Cordyceps militaris

HU Xiu-cai,LV Ai-jun
(Jiangsu Normal University,Xuzhou 221116,China)

Comparing with the function pharmacology and drug effect,Cordyceps militaris was similar with Cordyceps sinensis，which had been provided substitution of Cordyceps sinensis.However,the degenerate subcultures of C.militaris had increasingly reduced the production of this economically important fungus.In this paper,the development progresses of Cordyceps militaris degenerate subculture in morphological,genetic and changes fruit bodies changes were summed up.At the same time,we prospect the current research existence questions and the technique solution of degenerate subculture.

Cordyceps militaris;degenerate subculture;wild strains of C.militaris

S646.9

A

1003-8310（2015）01-0001-03

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.01.001

江蘇師范大學(xué)?？蒲谢鹬攸c(diǎn)項(xiàng)目（11XLA20）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31272692）；江蘇省“青藍(lán)項(xiàng)目”（QL2014013）。

胡秀彩（1976-），女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事資源微生物學(xué)研究。E-mail:huxiucai@126.com

**通信作者：呂愛(ài)軍（1973-），男，博士，副教授，主要從事微生物及免疫學(xué)研究。E-mail:lajand@126.com

2014-11-10