林旋豪，王少洪，吳智勇，藍斌，李帆，肖坤勝，許秀娥，吳健誼，傅俊惠，章克毅，姚曉冬，范揚航，鄭海波，鄭春鵬，李銳雄，黃建豪，張仕義，陳捷鑫，李卓毅，朱天翔，楊彥龍，張澤淳，杜澤森，黃崇植，林曉榕，許小超，趙麟，許麗艷，李恩民

·生物樣本庫建設·

潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫的建立及其應用

林旋豪，王少洪，吳智勇，藍斌，李帆，肖坤勝，許秀娥，吳健誼，傅俊惠，章克毅，姚曉冬，范揚航，鄭海波，鄭春鵬，李銳雄，黃建豪，張仕義，陳捷鑫，李卓毅，朱天翔，楊彥龍，張澤淳，杜澤森，黃崇植，林曉榕，許小超，趙麟，許麗艷，李恩民

食管癌（esophageal cancer，EC）是全球常見八大惡性腫瘤之一，位居惡性腫瘤死亡率第六位［1-2］。依據組織病理類型分類，食管癌主要包括食管鱗癌和食管腺癌。食管鱗癌主要集中在亞洲的中東部和非洲等地區(qū)，而食管腺癌則在歐美等國家地區(qū)多發(fā)［3］。我國是世界上最主要的食管鱗癌高發(fā)國，食管鱗癌病例占全部食管癌病例的 90% 以上，并呈現明顯的地理性分布差異，主要分布在河北、河南和山西三省交界的太行山地區(qū)，閩粵交界的潮汕沿海地區(qū)，鄂皖交界的大別山地區(qū)，四川北部地區(qū)，新疆哈薩克族居民居住地區(qū)和蘇北地區(qū)等［4-5］。腫瘤流行病學調查結果表明，潮汕地區(qū)是我國唯一的沿海食管癌高發(fā)區(qū)，與我國其他內陸型食管癌高發(fā)區(qū)相比，其地理位置與氣候條件，以及當地居民飲食生活習俗等均明顯不同。1995-2004年的流行病學調查結果顯示，該地區(qū)食管癌的標化發(fā)病率為 74.47/105［6-7］。在潮汕當地，食管鱗癌的發(fā)病率一直高居各類惡性腫瘤之首。在此背景之下，毋庸置疑，建立潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫是十分重要的工作，對揭示食管癌，尤其是食管鱗癌的病因，闡明這種特殊惡性腫瘤發(fā)病的分子機制，尋找其早期癌變特異性分子標志物，以利于早期發(fā)現、早期診斷和早期治療，以及監(jiān)測治療后患者病情發(fā)展轉歸、預警預后等均有著十分重要的意義。

1 標本收集

由于食管癌發(fā)病癥狀比較晚，大部分患者就診時已處于中晚期［8］，甚至部分患者就診時就已經出現轉移。建立潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫的目的是采集、保存和利用好該特色疾病資源，滿足醫(yī)學科學研究的需要，同時以合作的方式為其他科研機構的研究者提供食管癌樣本，共享疾病研究資源，促進相關科學研究。

首先，我們建立潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫，是在國家863 重大專項基金的框架下實施的，其規(guī)則程序已經過汕頭市中心醫(yī)院倫理委員會審查，食管癌樣本的收集過程接受汕頭市中心醫(yī)院倫理委員會監(jiān)督。其次，在專業(yè)設計基礎之上，我們制定出食管癌組織，配對的食管癌旁組織與食管癌手術遠端切緣相對正常食管上皮組織，以及食管癌患者活檢組織與血液標本的收集計劃和使用規(guī)范。再次，上述所有生物標本的采集均簽署《知情同意書》，在不額外增加患者痛苦和不影響臨床病理診斷的原則下進行［9］。自 2007年11月，我們開始收集在汕頭市中心醫(yī)院腫瘤外科和心胸外科確診的食管癌患者，手術切除的食管癌組織、癌旁組織和遠端切緣相對正常食管上皮組織標本，以及食管癌患者活檢組織，分別以液氮速凍和石蠟包埋的方式進行處理。同時配對收集患者術前和術后血液標本，分離血清、血漿和淋巴細胞，標本經液氮速凍后保存于 -80 ℃ 超低溫冰箱。與此同時，通過生物樣本庫信息管理系統(tǒng)對上述各生物標本及其相關信息進行動態(tài)管理。

截至 2015年11月9日，本食管癌樣本庫已經收集石蠟組織標本 3264 例，冰凍組織標本 996 例，配套血液標本 835 例。

2 標本處理

在生物芯片上海國家工程研究中心的指導下，潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫已經完成《汕頭市中心醫(yī)院——生物樣本庫規(guī)劃建設方案》和《汕頭市中心醫(yī)院——生物樣本庫SOP》兩份指南性文件［10-12］，制定了嚴格、規(guī)范的操作流程，并在操作過程中嚴格執(zhí)行該標準化程序。本食管癌樣本庫工作人員均參加了中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會組織生物樣本庫分會組織的樣本庫標準化培訓，并獲得上崗證書。所有取材人員都經過一年以上的病理取材培訓，能夠在確保取材部位準確性的前提下進行快速規(guī)范地取材［13］。

⑴冰凍組織：分別選取切緣相對正常食管上皮組織、癌旁組織和食管癌組織，切割成 0.5 cm3的小組織塊裝管。

⑵石蠟組織：組織經程序化固定、脫水和包埋后制作成石蠟塊，常溫保存。

⑶血液：非抗凝血和抗凝血各 1 管，5 ml，靜置 30 min后在 4 ℃ 條件下，1200 × g 離心 10 min，分離其血清、血漿和淋巴細胞。血清和血漿在 4 ℃，1800 × g 條件下進行二次離心，離心 10 min 后分裝，分裝管數根據抽血量不同而各異，每管為 300 μl。

⑷速凍及保存：冰凍組織標本和血液標本分裝標注后，經液氮速凍 60 s，然后轉移到 -80 ℃ 超低溫冰箱進行長期保存。

3 數據錄入與隨訪

本庫選用無錫市朗珈生物醫(yī)學工程有限公司開發(fā)的生物樣本庫信息管理系統(tǒng)對入庫標本進行智能化管理，主要包括標本信息、標本相關信息和應用信息等［14］。標本信息如標本編碼、取材處理、儲存記錄及質量控制等信息；標本相關信息如患者臨床信息和隨訪信息等；應用信息如食管癌樣本使用者反饋的信息等。標本的編碼和儲存位置由管理軟件分配生成，患者臨床信息通過電子病歷系統(tǒng)和病理質控與資料管理系統(tǒng)提取生成。手工錄入的信息主要有生物標本的取材處理信息如分裝管數、石蠟塊數量和標本處理時間以及隨訪信息。潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫有專職工作人員從事患者的隨訪和數據庫更新，完善的隨訪信息有利于醫(yī)院臨床診療及醫(yī)學科學研究的進行。臨床醫(yī)師通過隨訪信息獲知治療結果，為評估臨床治療方案提供相關標準，有助于診療方案的完善和改進；醫(yī)學科學研究通過總生存期及無病生存期的分析作為研究課題是否具有臨床意義的重要證據。

4 質量控制

隨著功能基因組學和生物芯片技術研究的不斷深入，生物樣本的采集、儲存成為轉化醫(yī)學研究的重要組成部分，組織的取材是否具有代表性、保存標本的質量如何等都是需要重點關注的問題，因此，建立質量管理體系是建設標準化、高質量生物樣本庫的重要環(huán)節(jié)［15］?；跇吮揪幋a，潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫定期采用 Excel 軟件生成隨機數表的方式進行抽樣檢測，抽取石蠟組織標本進行 HE 染色，評估取材準確性和腫瘤細胞占比；定期檢測食管鱗癌冰凍組織的 DNA、RNA 和蛋白質的完整性，比例約為 2%［16］。

⑴儲存條件：本食管癌樣本庫配備了自動化溫控監(jiān)測系統(tǒng)，對室溫、超低溫冰箱和液氮罐進行 24 h 持續(xù)監(jiān)控，監(jiān)測頻率為 30 min/次。

⑵腫瘤細胞比例：隨機抽取標本，經切片、蘇木素和伊紅染色后在鏡下評估腫瘤細胞的百分比，大于 80% 為良好，小于 65% 為不合格。

⑶核酸完整性：定期抽取標本，利用紫外分光光度計檢測核酸的豐度和純度，采用瓊脂糖電泳測定組織樣本的DNA 和 RNA 的完整性。

⑷蛋白質完整性：定期抽取標本，采用 Western blot 測定目標蛋白的完整性。

⑸信息準確度：對生物樣本信息進行抽檢，檢查其完整性和準確性。主要是檢查新入庫樣本的標本信息和患者臨床信息是否完整，虛擬庫與實體庫的位置是否對應等。通過系統(tǒng)查詢并打印存檔來校對和控制相關信息的完整性。

本食管癌樣本庫儲存的標本經組織學、分子生物學等質量控制技術檢驗顯示符合研究要求，可以支持各相關科學研究。

5 應用

本潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫是汕頭市中心醫(yī)院和汕頭大學潮汕沿海地區(qū)高發(fā)腫瘤分子生物學廣東省高校重點實驗室（汕頭大學醫(yī)學院生化與分子生物學教研室）合作共建，主要為建庫雙方和其他合作單位提供資源進行相關科學研究，樣本使用者必須具有一定的資質，能妥善利用樣本資源。同時，要求使用者及時反饋樣本使用情況，包括生物標本 DNA/RNA/蛋白質量等基本質量信息，也包括課題產生的部分特有實驗數據，以利于生物樣本庫的改進和不斷發(fā)展。

2007年以來，該特色生物樣本庫共支持各類科研項目累計 20 余項，主要包括國家 863 重大科研專項 3 項，NSFC-廣東聯合基金重點項目 2 項，國家自然科學基金面上項目 6 項，國家自然科學基金青年基金項目 6 項等，在Nature、Clin Cancer Res、J Pathology 等期刊雜志上發(fā)表 SCI收錄研究論文 30 余篇，累計 SCI 影響因子大于 120。

6 小結

按照生物樣本庫建立規(guī)范標準，我們已成功建立了潮汕沿海地區(qū)食管癌樣本庫，而且利用該特色生物樣本庫促進相關科學研究成效顯著。

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國家 863 重大專項（2012AA02A209、2012AA02A503）

515051 汕頭市中心醫(yī)院病理科（林旋豪、王少洪、李帆、肖坤勝），腫瘤外科（吳智勇、傅俊惠、章克毅、姚曉冬、范揚航、鄭海波、鄭春鵬、黃建豪、張仕義、陳捷鑫、李卓毅、張澤淳、杜澤森、黃崇植、林曉榕、許小超、趙麟），心胸外科（藍斌、李銳雄、朱天翔、楊彥龍）；515041 汕頭大學醫(yī)學院生化與分子生物學教研室（許秀娥、吳健誼、李恩民），潮汕沿海地區(qū)高發(fā)腫瘤分子生物學廣東省高校重點實驗室（吳健誼、許麗艷、李恩民）

王少洪，Email：w196303@sohu.com；吳智勇，Email：stwuzy@163.com；藍斌，Email：swatowdoctor@126.com

2015-11-19