王志強綜述，王慶松審校

血管性認知障礙(vascular cognitive impairment，VCI)自1993 年首次提出后，已經成為近20 y 來社會關注的焦點，也是神經科學領域研究的熱點。VCI 的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其發(fā)病率僅次于Alzheimer 病(Alzheimer disease，AD)，是引起老年期癡呆、導致老年生活質量下降的重要因素之一。雖然VCI 的臨床研究取得了一定進展，但是VCI 的發(fā)病機制及病理生理變化仍然不明確，因此迫切的需要更多的基礎研究為VCI 的預警診治提供理論依據(jù)。

臨床研究與基礎研究最大的區(qū)別就是臨床研究可以通過MMSE、Moca 等各類量表來直接反應患者的認知狀況，而對動物認知障礙的認定只能通過各類評價工具來完成。但是，文獻報道的認知評價工具及其應用各種各樣，所以我們分析了近年來文獻常用的評價方法及其應用，總結出目前常見的對實驗動物認知功能的評價主要集中在參考記憶、工作記憶等。

1 參考記憶評價

空間記憶障礙是目前VCI 研究最多也最全面，空間記憶是指記憶中負責記錄環(huán)境信息和空間方位的部分。

1.1 Morris 水迷宮 Morris 水迷宮(morris water maze，MWM)是利用動物求生本能促使其在水池內游泳找到逃生平臺，參考記憶的評價通常包含定位航行、空間探索等階段。MWM 是目前世界公認的較為客觀的學習記憶功能評價方法［1］，主要是由于動物訓練所需的時間較短，有利于急性期的認知評價;同時在迷宮內的線索，例如氣味可以被消除掉;動物在實驗中不需要禁食;MWM 較放射臂迷宮對學習記憶檢測的靈敏度更高，在腦缺血后7 d 放射臂迷宮沒有陽性發(fā)現(xiàn)時就能發(fā)現(xiàn)實驗動物的參考記憶受損。由于國內外學者收集參數(shù)及排除標準不同，雖然作為經典的學習記憶評價工具近年來其實驗結果的可信度引起國內外學者的質疑。例如:(1)不適合長期記憶功能的評價及重復實驗，采用厭惡逃避測試本身就會產生應激，增加了混雜因素，增加假陽性風險;(2)非認知因素，如活動能力、聽覺、嗅覺、觸覺、焦慮抑郁等可能影響實驗結果的可靠性［2］;(3)實驗結果不能很好的反映組織病理結果［3］;(4)MWM 主要是反映海馬依賴的視空間記憶功能，對于嚴重的缺血(全腦缺血模型)損傷皮質、丘腦等結構引起的認知缺陷無法反映。所以，Bingham 等在大量實驗的基礎上提出了排除標準以排除混雜因素干擾［2］。

1.2 Barnes 迷宮 Barnes 迷宮(barnes maze，BM)是基于動物運動功能受損時MWM 會增加假陽性率的需求而形成的。因為BM 對動物的體能消耗較少，理論上BM 是利用齲齒動物喜好陰暗環(huán)境的特點，通過平臺外的空間定位信息作為線索，有效確定躲避場所的部位。與MWM 類似，實驗過程通常包括學習訓練實驗和探索實驗。BM 不需要食物剝奪和足底電擊，因此對動物的應激較小;實驗對于動物的體力要求很小，能最低限度的減少因年齡因素所致的體力下降對實驗結果的影響;實驗所需時間較少，根據(jù)各種實驗方案的不同整個實驗能在5～10 d［4，5］內完成。BM 在皮質下血管性癡呆引起參考記憶受損［5］、微栓子引起血管性癡呆［4］等模型中廣泛使用。不僅能反映血管性認知障礙時海馬CA1神經元的損傷與再生，而且還與內嗅皮質與齒狀回之間突觸連接數(shù)量的降低相關［6］。但是微栓子引起的認知功能障礙出現(xiàn)之前就已經存在焦慮抑郁等神經功能異常［4］，所以BM 評價空間學習記憶障礙的可靠性同樣受到情感行為的影響。

1.3 放射臂迷宮實驗 放射臂迷宮(radial arm maze，RAM)最早是由Olton 及其同事設計的，利用房間內提供的視覺參照信息，可以有效地確定放置食物的臂所在部位，目前最常用的是8 臂迷宮。參考記憶錯誤是指動物進入不曾放過食粒的臂。理論上RAM 是由食物獎勵驅使的任務。其重復測量的穩(wěn)定性較好。主要不足是開始實驗前動物需要食物剝奪，動物及食物氣味可能對實驗結果產生干擾［7］。雖然實驗動物的選擇空間有限，但是目前認為RAM 仍然是一個測試參考記憶和工作記憶有效且靈敏的工具。RAM 已廣泛用于慢性腦缺血(雙側頸總動脈阻斷法［8］、四血管阻斷法［9］)、頸總動脈狹窄模型［5］、危險因素［10］引起認知障礙的研究，為了排除視覺受損的干擾，在不同的臂內可以鋪以不同質地的紙張來幫助實驗動物導航［8］。

近年來應用的放射臂水迷宮(radial-arm water maze，RAWM)類似于MWM 和RAM 的結合，結合了MWM 和RAM的優(yōu)點，因此敏感性更高能發(fā)現(xiàn)單側頸總動脈阻斷法引起的輕度認知障礙［7，10］。

1.4 主動/被動回避實驗 根據(jù)所用儀器設備的不同又可分為明/暗箱回避［9］、穿梭回避、跳臺回避等，回避實驗主要反映皮質功能［11］。所以回避實驗在技術上與暗示關聯(lián)條件恐懼相類似。根據(jù)動物的逃避方式分為主動回避和被動回避(active/passive avoidance)?；乇軐嶒灪唵我仔校^察指標多。但動物的反應差異性較大，要注意實驗動物的篩選。由于主動回避的假陽性率較被動回避的假陰性率高，所以多采用被動回避實驗。但是被動回避實驗結果與組織病理結果相關性較差［12］。

主動位置回避(active place avoidance，APA)類似于主動回避，但是可以減少主動回避假陽性率。是指緩慢旋轉的圓形平臺上某一固定的象限設定為電擊區(qū)域，平臺在旋轉但是電擊區(qū)域不變，實驗動物通過學習避免固定的電擊區(qū)域，同樣是利用實驗動物對厭惡刺激(如足電擊)的恐懼和記憶而建立起來的。較傳統(tǒng)主動回避實驗更復雜，因為實驗動物需要忽略轉盤上的嗅覺參照而通過視覺觀察遠處參照物來避免電擊，主要通過電擊次數(shù)評價學習記憶功能，運動總距離評價運動功能。Zhou 等通過對比發(fā)現(xiàn)，在大腦中動脈阻斷的血管性認知障礙模型中APA 較被動回避的敏感性更高［12］。

1.5 金字塔任務 金字塔任務(ziggurat task，ZT)是利用空間參考信息讓實驗動物有效確定食物放置的金字塔所在位置，以此考驗動物的記憶能力。實驗開始之前實驗動物必須經過1 w 的飲食限制。實驗過程包含學習階段(4 d)、記憶階段和探索階段。實驗的過程由學習(第1、3、5、7 天)和記憶(第2、4、6、8 天)交替組成-在每個奇數(shù)天讓大鼠尋找裝有食物的新的目標金字塔，在每個偶數(shù)天目標位置不變，測試大鼠是否能尋找到先前的目標金字塔。第9 天是探索測試，在第一次測試食物放置在新的位置，實驗動物需要探索學習以獲得獎勵，在第2 次和第3 次測試中不提供食物測試對前一次的記憶能力［13］。海馬損傷大鼠在ZT 實驗中學習記憶功能較對照組明顯下降。因此該實驗也是反映海馬功能的有效的評價工具。金字塔任務較MWM 及RAM 等經典的評價工具有明顯的優(yōu)勢:(1)最大的優(yōu)點是能測試環(huán)境類似動物生活環(huán)境，對實驗動物應激較小;(2)實驗動物需要垂直及水平空間定位才能完成任務，不像MWM 及RAM 等經典的評價工具只能測試水平位置的空間定位能力;(3)由于該方法對實驗動物體力消耗少、環(huán)境舒適等特點，所以該方法中實驗動物的焦慮、抑郁等癥狀發(fā)生率較低;(4)同樣可以通過不同計算方法同時評價工作記憶與參考記憶。

2 工作記憶評價實驗

執(zhí)行功能(executive function)是個體的許多認知加工過程的協(xié)同操作。它涉及對個體的意識和行為進行監(jiān)督和控制的各種操作過程，包括自我調節(jié)、認知靈活性、反應抑制、計劃等。而工作記憶(working memory，WM)是評價實驗動物執(zhí)行功能最常用的方法。工作記憶是指在執(zhí)行認知任務過程中，用于信息的暫時儲存與加工的過程［14］。工作記憶在人類及齲齒動物是依賴于前額葉皮質來完成的［14］。評價工作記憶的常用方法有如下幾類。

2.1 自主交替實驗 T、Y 迷宮自主交替(spontaneous altemation on a T/Y-maze)用來評價實驗動物學習轉換能力。即使沒有食物獎賞，大鼠仍然保留對所探究區(qū)域有一定的新奇感。自發(fā)轉換的次數(shù)/總選擇次數(shù)用來說明工作記憶功能，VCI 動物比值得分下降。正常的交替操作與完整的工作記憶能力相一致。T 迷宮和Y 迷宮自主轉換實驗［15，16］已被廣泛用于VCI 研究。而且，在雙側頸總動脈狹窄模型及雙側頸總動脈逐步阻斷模型［17］中出現(xiàn)選擇性的工作記憶受損。

2.2 MWM 工作記憶 是指Morris 水迷宮基礎上改造的實驗方法，通過每天改變逃生平臺放置的位置，迫使實驗動物找到新的逃生平臺的位置［18］，也稱作延遲匹配樣本任務(delayed matched to sample task，DMST)。主要是通過為期4 d 的訓練，訓練方法與參考記憶的方法相同，只不過每天改變逃生平臺的位置，迫使實驗動物每天都學習新的逃生平臺的位置。通過每天第一次訓練時的逃離潛伏期和第四次測試階段的逃離潛伏期對比來觀察工作記憶能力［1，18，19］。

還有學者通過每天兩次訓練配對方法來完成工作記憶的測定。主要過程如下:實驗包含12 d，每天訓練兩次，每天的第一次訓練是為了信息獲取，逃離平臺放置在與前1 d 訓練不同的位置;第2 次為記憶保持測試，逃離平臺放置在與信息獲取訓練相同的位置。每3 d 為一組，每組兩次訓練之間間隔時間為30 s、30 min、2 h、6 h［20］。

也有學者通過對位訓練(reveral phase)測定動物的工作記憶。主要過程如下:探查訓練結束后，將平臺放在原先平臺所在象限的對側象限，方法與獲得性訓練相同。對位探索訓練是在最后一次對位訓練的第2 天進行，方法與上述探查訓練類似。但是也有學者認為對位訓練屬于參考記憶，只是能增加參考記憶的敏感性［21］。另外MWM 還可以進行延遲非樣本匹配任務、辨別學習等不同版本［22］。

但是通過MWM 測定工作記憶耗時較長，經過參考記憶訓練后應激會增加實驗干擾因素，所以應用較放射臂迷宮少。

2.3 放射臂迷宮實驗 實驗動物利用房間內遠側線索所提供的信息，可以有效地確定放置食物的臂所在部位。實驗方法與參考記憶評價方法相同，只是計算方法不同，工作記憶錯誤(working memory errors)是指在同一次訓練中動物再次進入已經吃過食粒的臂，水迷宮不同，放射臂迷宮適合反復測試或長期記憶的測試，而且工作記憶與參考記憶可以同時完成。雙側頸總動脈狹窄引起認知障礙大鼠在30 d 和6 m 后工作記憶明顯受損，與前額葉皮質下神經環(huán)路的損傷相關，這與臨床皮質下缺血性血管性癡呆類似［5］。在放射臂迷宮中測試中，2-VO 大鼠在術后21 d 就出現(xiàn)工作記憶障礙，在此后6 m 內沒有明顯的進行性加重。雙側頸總動脈狹窄小鼠30 d 后在RAM 中出現(xiàn)選擇性的工作記憶受損而參考記憶未見異常［23］。

2.4 金字塔任務 實驗主要過程與ZT 空間記憶評價過程完全相同，實驗參數(shù)評價方式與RAM 評價方式相同。該方法已在微栓子引起認知障礙中證明是可靠的評價方法［13］。ZT 與RAM 在評價工作記憶方面，不論從實驗原理、實驗過程及評價方式上都有許多相似之處。其最大優(yōu)勢主要在于測試空間參考記憶方面;而與MWM 相比，其主要是測試環(huán)境較為舒適，對實驗動物刺激較小，因此能更精確的反映真是的認知狀況。

2.5 洞板實驗 洞板實驗通常包含適應、訓練和測試3個階段。實驗者可根據(jù)實驗目的選擇需要的實驗階段來進行［24］。由于普通洞板可能存在食物氣味干擾，后來出現(xiàn)了改良洞板實驗(modified hole board test，mHB)，在每個洞內固定食物做誘餌，其中數(shù)個(3 個)洞內另外放置能夠取出并食用的食物。主要觀察指標有選擇錯誤次數(shù)，忽略次數(shù)，重復選擇次數(shù)。動物進入沒有食物洞的次數(shù)(選擇錯誤)，或者沒有進入提供食物洞的次數(shù)(忽略錯誤)可用來評價參考記憶;動物重復進入提供食物的洞(重復選擇)用來評價工作記憶;初次進洞潛伏期，進洞次數(shù)，在板上停留時間/測試總時間，靜止時間/總時間焦慮抑郁等。較MWM 測試，mBH 動物飼養(yǎng)及測試環(huán)境沒有應激因素，避免混雜因素的干擾;較RAM沒有食物剝奪，而是提供對實驗動物高度誘惑的食物獎勵，從而使動物能很好的配合實驗;其次，mBH 能同時測試運動、認知及行為參數(shù)，便于控制組間配合，實驗結果可信度更高。改良洞板測試在VCI 研究中的應用較少［25］?？赡苁怯捎谠搶嶒灪臅r較長，適應、訓練階段就需要14 d 來完成［24］，不適于短期實驗的應用。

2.6 物體辨別實驗 物體識別實驗(object recognition test，ORT)是利用動物先天對新物體有探索傾向的原理而建立的學習記憶測試方法。該方法具有讓實驗動物在自由活動狀態(tài)下進行學習記憶測試的特點，能更近似地模擬人類的學習記憶行為。根據(jù)測試間隔時間可評價短期記憶(15 min)和長期記憶(24 h)。實驗動物對環(huán)境中兩個相同物體的熟悉期，記錄大鼠與這兩個物體接觸的情況。然后將熟悉物體的其中一個換做新物體，主要觀察大鼠對新物體的探究情況。在ORT 中分別記錄實驗期探索熟悉物體(TF)和探索新物體(TN)的時間。實驗期對新物體的識別指數(shù)(recognition indices，RI)被定義成TN/(TF+TN)×100%、辨別指數(shù)(discrimination indices，DI)TN -TN/(TF+TN)×100%［19，21］。這種方法可以說是一種單純的工作記憶測試，完全不同于參考記憶;而且與靈長類工作記憶相似能夠相互比較;完全依賴于動物天性來測試不需要強化，所以得到廣泛應用。

雖然執(zhí)行功能在人類認知功能中占有很重要的地位，因而研究非常廣泛，但是在動物實驗中卻很少研究，或者很少將執(zhí)行功能缺陷單獨進行討論。執(zhí)行功能主要依賴于前額葉皮質結構、功能的完整性，但是在腦血管病動物模型中其他腦區(qū)(海馬、紋狀體等)也受到影響，所以單獨說明前額葉皮質與執(zhí)行功能之間的直接關系存在一定難度。

3 總結與展望

目前對于學習記憶的研究進展十分迅速，各種學習記憶的理論不斷涌現(xiàn)。按照這些理論而設計的動物模型及認知功能評價工具也不斷出現(xiàn)。而各種先進實驗技術及影像學技術，如神經電生理技術的LTP、ERP 和腦成像技術的功能核磁共振成像都被應用于學習記憶的研究中，給學習記憶的研究開辟了一條新的途徑。因此，如何對傳統(tǒng)的行為學評價方法進行統(tǒng)一規(guī)范，制定標準的評價流程，不僅有利于不同實驗之間的比較，更有利于把傳統(tǒng)的行為學研究方法和最新的研究技術相結合，為學習記憶的研究提供更廣闊的思路。

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