管彩虹 趙 凱 樓雅芳 朱黎紅 吳 清

趨化因子CCL22對肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

管彩虹1趙 凱2樓雅芳1朱黎紅1吳 清1

目的觀察趨化因子CCL22對肺癌SBC-5細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。方法取肺癌細(xì)胞系SBC-5細(xì)胞，RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，5%CO2培養(yǎng)箱孵育，清洗消化后傳代培養(yǎng)。予100ng/mL的 CCL22誘導(dǎo)肺癌 SBC-5細(xì)胞，設(shè) Control組、CCL22組（100ng/mL）、MIX 組（CCL22 100ng/mL+蛋白激酶抑制劑U0126 10μmol），觀察細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化；加入蛋白激酶抑制劑（U0126）后細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化。結(jié)果CCL22誘導(dǎo)肺癌SBC-5細(xì)胞后，CCL22組細(xì)胞遷移距離（351.9±16.4）μm，明顯大于 Control組的（112.6±27.2）μm 和 MIX 組的（145.1±29.6）μm（P＜0.05），MIX 組和Control組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。CCL22組平均侵襲細(xì)胞數(shù)（505.5±66.3）個，顯著高于 Control組的（199.2±32.8）個和 MIX 組的（95.7±19.1）個（P＜0.05），MIX 組明顯低于 Control組（P＜0.05）。結(jié)論趨化因子CCL22可在體外誘導(dǎo)肺癌SBC-5細(xì)胞遷移和侵襲，而蛋白激酶抑制劑（U0126）可抑制CCL22誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的遷移及侵襲。

肺癌細(xì)胞；趨化因子CCL22；腫瘤侵襲；腫瘤轉(zhuǎn)移

肺癌常發(fā)生骨、肝臟等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中，靶器官的趨化作用至關(guān)重要。既往研究發(fā)現(xiàn)，分化的破骨細(xì)胞可產(chǎn)生趨化因子CCL22，其相應(yīng)的受體為CCR4。我們通過實驗觀察趨化因子CCL22能否誘導(dǎo)可表達(dá)CCR4的肺癌細(xì)胞（SBC-5細(xì)胞）發(fā)生遷移和侵襲，為肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 肺癌細(xì)胞系SBC-5（廣州吉妮歐生物科技有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（SIGMA公司）；胎牛血清（FBS，Hyclone公司）；蛋白激酶抑制劑（U0126，SIGMA 公司）；PVDF膜（Millipore公司）；ECL Plus發(fā)光試劑盒、Western及IP細(xì)胞裂解液（碧云天公司）；倒置相差顯微鏡（ECLIPSE Ti-S型，Nikon公司）；流式細(xì)胞儀（Accuri C6型）和24-well transwell（BD公司）；凝膠成像儀（Bio-RAD公司）；其他試劑系國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SBC-5細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇，用10%FBS1×P.S.RPMI-1640培養(yǎng)基 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)，磷酸鹽緩沖液（0.01M PBS）清洗，0.25%Trypsin消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)并調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.2 細(xì)胞遷移能力檢查 采用劃痕實驗。取對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%Trypsin消化、細(xì)胞計數(shù)，以1×106/孔細(xì)胞量布6孔板，待細(xì)胞貼壁后，以1%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基同步化24h。垂直于平行線用200μL槍頭垂直6孔板布滿細(xì)胞底部劃線。用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基漂洗兩遍。在顯微鏡下選擇背景最好的三個區(qū)域拍照（×100）。設(shè) Control組、CCL22 組（100ng/mL）、MIX 組（CCL22 100ng/mL+蛋白激酶抑制劑U0126，10μmol），每組完全培養(yǎng)基加入相應(yīng)藥物，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育24h。在相差顯微鏡下觀察各組三個選擇區(qū)域24h后的遷移情況，拍照（×100）。

1.2.3 Transwell試驗觀察細(xì)胞侵襲能力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基同步化24h。將在4℃融好的Matrigel用冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，取100μL稀釋膠（～25μg）加到24-well transwell上室。放置37℃孵育過夜包被基底膜，取出transwell板，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基輕洗凝膠。取同步化24h細(xì)胞0.25%Trypsin消化，收集，計數(shù)。制備 5×106/mL，1%FBS RPMI-1640 細(xì)胞懸液。取200μL加入上室，下室加入600μL各組培養(yǎng)基。每組完全培養(yǎng)基加入相應(yīng)藥物，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育24h。用棉簽擦去上室非侵襲細(xì)胞，移去transwells，倒置，風(fēng)干。在24孔板中加入500μL含0.1μg結(jié)晶紫，把小室放入其中，37℃孵育30min。取出，PBS清洗。直徑上取四個視野，拍照（×100），計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 檢測數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCL22對SBC-5細(xì)胞遷移能力影響 CCL22誘導(dǎo)SBC-5細(xì)胞后，Control組細(xì)胞平均遷移距離（112.6±27.2）μm，CCL22 組 細(xì) 胞 平 均 遷 移 距 離（351.9±16.4）μm，MIX 組細(xì)胞平均遷移距離（145.1±29.6）μm。CCL22組細(xì)胞遷移距離明大于 Control組和MIX組（P＜0.05），MIX組和Control組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖 1～2（插頁）。

2.2 CCL22對SBC-5細(xì)胞侵襲能力影響 CCL22誘導(dǎo)SBC-5細(xì)胞24h后，穿過基地面細(xì)胞數(shù)以平均侵襲細(xì)胞數(shù)±樣本標(biāo)準(zhǔn)差表示。Control組平均侵襲細(xì)胞數(shù)（199.2±32.8）個，CCL22組平均侵襲細(xì)胞數(shù)（505.5±66.3）個，MIX組平均侵襲細(xì)胞數(shù)（95.7±19.1）個。CCL22組顯著高于Control組和MIX組（P＜0.05），MIX組明顯低于 Control組（P＜0.05），見圖3～4（插頁）。

3 討 論

研究[1]證實，靶器官產(chǎn)生的一些細(xì)胞因子（如白介素、細(xì)胞核因子κB配基受體激活劑、趨化因子等）與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的特異性受體結(jié)合，在腫瘤細(xì)胞的遷移種植過程中發(fā)揮著重要作用。

趨化因子家族是一類由免疫或非免疫細(xì)胞分泌的一級結(jié)構(gòu)相似的小分子蛋白，具有多種生物活性，根據(jù)其氨基酸序列上前兩個半胱氨酸相對位置不同，可以分為4類，CCL22就是其中一類，在人體中位于16號染色體的CCL22基因編碼上，由樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生。Nakamura等[2]研究發(fā)現(xiàn)分化的破骨細(xì)胞也可產(chǎn)生趨化因子CCL22，其相應(yīng)的受體為 CC 趨化因子受體 4（CCR4）。Phillips等[3]證實了趨化因子CXCLl2及其相應(yīng)受體CXCR4在非小細(xì)胞肺癌嗜器官轉(zhuǎn)移中具有重要作用。本實驗應(yīng)用100ng/mL的CCL22處理肺癌SBC-5細(xì)胞，24h后細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力明顯增加，說明肺癌轉(zhuǎn)移過程不是隨機(jī)的，而是有靶器官趨向性。因此，靶器官組織中的趨化因子和肺癌細(xì)胞中的特異性受體同時高表達(dá)在肺癌的器官特異性轉(zhuǎn)移的過程中起著非常關(guān)鍵的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)加入蛋白酶抑制劑U0126后，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲性明顯減弱。以往的研究顯示U0126主要是抑制細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）磷酸化[4]，ERK可將細(xì)胞外刺激傳遞至細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化等一系列生理活動，并在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)展中起重要作用。趙凱等[5]研究發(fā)現(xiàn)，ERK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中被明顯激活。所以除了趨化因子參與腫瘤轉(zhuǎn)移外，是否還有其它因子或酶參與，有待進(jìn)一步研究。

因此，腫瘤的轉(zhuǎn)移部位不是隨機(jī)性，而是有一定的趨向性，趨化因子CCL22在體外可以誘導(dǎo)肺癌SBC-5細(xì)胞遷移和侵襲，蛋白激酶抑制劑（U0126）可以抑制CCL22誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞遷移及侵襲。實驗結(jié)果可能會為肺癌轉(zhuǎn)移的治療提供新的實驗依據(jù)。

［1］ Vander Griend DJ，Rinker Schaeffer CW.A new look at an old problem：the survival and organ-specific growth of metastases［J］.Sci STKE，2004，（216）：3-9.

［2］ Nakamura Es，Koizumi K，Kobayashi M，et al.RANKL-induced CCL22/macrophage-derived chemokine produced from osteoclasts potentially promotes the bone metastasis of lung cancer expressing its receptor CCR4［J］.Clin Exp Metastasis，2006，23（1）：9-15.

［3］Phillips RJ，Burdick MD，Lutz M，et a1.The stromal derived Factor-1/CXCLl2-CXC chemokine recenter-4 biological axis in non small cen lung cancer metastases［J］.Am J Respir Crit Care Med，2003，167（12）：1676-1681.

［4］Ahn NG，Nahreini TS，Tolwinski NS，et al.Pharmacologic inhibitors of MEK1 and MEK2［J］.Methods Enzymol，2001，332：417-431.

［5］趙凱，譚群亞，楊翀，等.干擾ERK/p-38 MAPK信號通路對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響［J］.中華實驗外科雜志，2011，28（2）：311.

（收稿：2014-06-20 修回：2014-08-01）

Effects of Chemokine CCL22 on Lung Cancer Cell Migration and Invasion

GUAN Caihong1，ZHAO Kai2，LOU Yafang1，ZHU Lihong1，WU Qing1.1 Department of Respiratory Medicine,Hangzhou TCM Hospital,Hangzhou(310009),China;2 Department of Surgery,Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou（310003），China

Objective To investigate the effect of chemokine CCL22 on migration and invasion of lung cancer cell line SBC-5.MethodsLung cancer cell line SBC-5 cells were cultured with RPMI-1640 medium and incubated in an incubator with 5%CO2,then the cell was washed and digested to subculture.The SBC-5 cells subcultured were divided into control group,CCL22 group（100ng/mL）,and MIX group（CCL22 100ng/mL+protease inhibitor U0126 10μmol）.The cells were treated with the corresponding drugs in each group.Capability of lung cancer cell migration and invasion was observed after treatment in each group.ResultsAfter induction with CCL22,the migration distance of SBC-5 cells was increased（351.9±16.4μm）compared with that in control（112.6±27.2μm）and MIX group（145.1±29.6μm,all P＜0.05）;no significant difference in the migration distance was noted between control and MIX groups（P＞0.05）.Cell invasion in CCL22 group（505.5±66.3） was seen more than that in control（199.2±32.8）and MIX groups（95.7±19.1,all P＜0.05）,and a significant difference was found between the latter two groups（P＜0.05）.ConclusionChemokine CCL22 can induce migration and invasion of lung cancer cell line SBC-5 in vitro,while protease inhibitor（U0126）may inhibit the migration and invasion of lung cancer cells induced by CCL22.

lung cancer cells；chemokine CCL22；tumor invasion；tumor migration

p

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（No.2011KYA138）；杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（No.2011A046）

1杭州市中醫(yī)院呼吸科（杭州 310009）；2杭州市紅十字會醫(yī)院外科（杭州 310003）

趙凱，E-mail：zhaokaiguan@126.com